Analisis Ekspresi Gen IGF-I dan GHR-1
dibuat 3 µg dalam 30 µL DEPC, kemudian diinkubasi pada suhu 65°C selama 10 menit dan diletakkan dalam kondisi on ice. Sampel RNA dipindahkan ke dalam
microtube FSRMB dan ditambahkan 3 µL primer „dT3‟RACE-VECT‟ 5‟-GTA
ATA CGA CTC ACT ATA GGG CAC GCG TGG TCG ACG GCC CGG GCT GGT TTT TTT TTT TTT TTT TTT -
3‟ dengan konsentrasi 1 µg3 µL. Larutan dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 1 jam. cDNA yang
terbentuk ditambahkan 30 µL SDW steril dan disimpan dalam refrigerator hingga digunakan.
Ekspresi gen IGF-1 dan GHR-1 dideteksi menggunakan metode semi- kuantitatif PCR dengan primer IGF1-
F: 5‟-TTCAAGAGTGTCATGTGCTGTA- 3‟ dan IGF1-R 5‟-CATAGCCTGTTGGTTTACTGAA-3‟ untuk amplifikasi gen
IGF-1, GHR1- F: 5‟-ACCGGCCACAACATGAATATAAGG-3‟ dan GHR1-R:
5‟-GTCTTGATCAGGCAGGTCTGG-3‟ untuk amplifikasi gen GHR-1 Irmawati, belum dipublikasikan. Kondisi PCR untuk IGF-1 adalah predenaturasi
pada 94°C selama 3 menit, 35 siklus pada denaturasi 94°C selama 30 detik, annealing 57°C selama 30 detik, ekstensi 72°C selama 30 detik, dan ekstensi
akhir pada 72°C selama 3 menit. Kondisi PCR untuk GHR-1 adalah predenaturasi pada 94°C selama 3 menit, 35 siklus pada denaturasi 94°C selama 30 detik,
annealing 60°C selama 30 detik, ekstensi 72°C selama 30 detik, dan ekstensi akhir pada 72°C selama 3 menit.
Ekspresi gen β-aktin dianalisis sebagai kontrol internal loading RNA saat sintesis cDNA. Primer yang digunakan untuk gen β-aktin adalah primer F 5‟-
AAC CAT GGA TGA TGA AAT CGC CGCA- 3‟ dan R 5‟-TGA TGC CTG
GGG CGA CCG ACG ATGG - 3‟ Irmawati, belum dipublikasikan dengan
kondisi PCR adalah predenaturasi pada 94°C selama 3 menit, 28 siklus pada denaturasi 94°C selama 30 detik, annealing 59°C selama 30 detik, ekstensi 72°C
selama 30 detik, dan ekstensi akhir pada 72°C selama 3 menit. Pengecekan hasil amplifikasi PCR dilakukan dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1,5.
Pengukuran level IGF-1 dan GHR-1 dilakukan dengan mengukur ketebalan pita DNA hasil elektroforesis menggunakan software UN-SCAN-IT gel 6.1, kemudian
hasilnya dibandingkan dengan gen β-aktin yang digunakan sebagai kontrol.