dalam oven bersuhu 105-110°C, sedangkan untuk proksimat dari daging ikan mengikuti metode Folch Takeuchi 1988.
3.7 Analisis Ekspresi Gen IGF-I dan GHR-1
Analisis ekspresi gen IGF-I dan GHR-1 dilakukan untuk mendapatkan informasi tentang ekspresi gen IGF-I dan GHR-1 akibat introduksi dari rGH
eksogen dengan cara mengambil sampel otak dan hati ikan gurame dari masing- masing perlakuan dosis rGH terbaik dan kontrol. Pengambilan sampel dilakukan
pada akhir perlakuan, yakni setelah pemberian pakan rElGH diberhentikan selama 4 minggu, selanjutnya ikan dipindahkan ke dalam akuarium. Pemberian pakan
yang mengandung rElGH, dan pakan kontrol dilakukan setelah ikan dipuasakan selama sehari untuk mengosongkan isi lambung. Jaringan hati dan otak diambil
pada jam ke-24 setelah perlakuan. RNA total diekstraksi menggunakan isogen Nippon Gen, Japan sesuai
prosedur dalam manual. Jaringan tersebut dimasukkan ke dalam masing-masing microtube yang berisi larutan isogen 200 µL, kemudian dihancurkan dengan
menggunakan penggerus yang telah disterilkan dengan dietylpyrocarbonate DEPC 0,1. Ke dalam microtube ditambahkan larutan isogen hingga mencapai
volume akhir 800 µL dan diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang sampai semua jaringan terlisis sempurna. Setelah itu, kloroform ditambahkan sebanyak
200 µL, kemudian disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 12.000 rpm pada suhu ruang. Supernatan yang terbentuk dipindahkan ke dalam microtube
baru yang telah berisi 400 µL larutan isopropanol, kemudian disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 12.000 rpm pada suhu 4°C. Supernatan pada
microtube dibuang, dan pelet RNA pada dasar microtube dilarutkan dengan cara menambahkan 1 mL etanol 70 dingin, kemudian disentrifugasi selama 15 menit
dengan kecepatan 12.000 rpm. RNA dikeringkan dengan cara membuang larutan yang terdapat pada microtube. Setelah kering sempurna, RNA dilarutkan dengan
30 µL DEPC 0,1. Konsentrasi hasil isolasi RNA total diukur menggunakan alat pengukur konsentrasi RNADNA GeneQuant. Absorbansi diukur dengan
panjang gelombang 260, dan 280 nm. Sintesis cDNA IGF-1 dan GHR-1 dilakukan menggunakan kit Ready-to-
Go You-Prime First Strand Beads, FSRMB GE Healthcare. Konsentrasi RNA
dibuat 3 µg dalam 30 µL DEPC, kemudian diinkubasi pada suhu 65°C selama 10 menit dan diletakkan dalam kondisi on ice. Sampel RNA dipindahkan ke dalam
microtube FSRMB dan ditambahkan 3 µL primer „dT3‟RACE-VECT‟ 5‟-GTA
ATA CGA CTC ACT ATA GGG CAC GCG TGG TCG ACG GCC CGG GCT GGT TTT TTT TTT TTT TTT TTT -
3‟ dengan konsentrasi 1 µg3 µL. Larutan dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 1 jam. cDNA yang
terbentuk ditambahkan 30 µL SDW steril dan disimpan dalam refrigerator hingga digunakan.
Ekspresi gen IGF-1 dan GHR-1 dideteksi menggunakan metode semi- kuantitatif PCR dengan primer IGF1-
F: 5‟-TTCAAGAGTGTCATGTGCTGTA- 3‟ dan IGF1-R 5‟-CATAGCCTGTTGGTTTACTGAA-3‟ untuk amplifikasi gen
IGF-1, GHR1- F: 5‟-ACCGGCCACAACATGAATATAAGG-3‟ dan GHR1-R:
5‟-GTCTTGATCAGGCAGGTCTGG-3‟ untuk amplifikasi gen GHR-1 Irmawati, belum dipublikasikan. Kondisi PCR untuk IGF-1 adalah predenaturasi
pada 94°C selama 3 menit, 35 siklus pada denaturasi 94°C selama 30 detik, annealing 57°C selama 30 detik, ekstensi 72°C selama 30 detik, dan ekstensi
akhir pada 72°C selama 3 menit. Kondisi PCR untuk GHR-1 adalah predenaturasi pada 94°C selama 3 menit, 35 siklus pada denaturasi 94°C selama 30 detik,
annealing 60°C selama 30 detik, ekstensi 72°C selama 30 detik, dan ekstensi akhir pada 72°C selama 3 menit.
Ekspresi gen β-aktin dianalisis sebagai kontrol internal loading RNA saat sintesis cDNA. Primer yang digunakan untuk gen β-aktin adalah primer F 5‟-
AAC CAT GGA TGA TGA AAT CGC CGCA- 3‟ dan R 5‟-TGA TGC CTG
GGG CGA CCG ACG ATGG - 3‟ Irmawati, belum dipublikasikan dengan
kondisi PCR adalah predenaturasi pada 94°C selama 3 menit, 28 siklus pada denaturasi 94°C selama 30 detik, annealing 59°C selama 30 detik, ekstensi 72°C
selama 30 detik, dan ekstensi akhir pada 72°C selama 3 menit. Pengecekan hasil amplifikasi PCR dilakukan dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1,5.
Pengukuran level IGF-1 dan GHR-1 dilakukan dengan mengukur ketebalan pita DNA hasil elektroforesis menggunakan software UN-SCAN-IT gel 6.1, kemudian
hasilnya dibandingkan dengan gen β-aktin yang digunakan sebagai kontrol.
Kategori