Lokasi dan Waktu Penelitian Parameter Pengamatan

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan dan Rumah Kaca Kelompok Pemuliaan Tanaman, Pusat Aplikasi Teknologi Isotop dan Radiasi, Badan Tenaga Nuklir Nasional PATIR-BATAN, pada bulan Juli 2007 sampai dengan Februari 2008. 3.2 Bahan dan Alat 3.2.1 Bahan Bahan utama yang digunakan adalah eksplan dari padi varietas Diah Suci DS sebagai kontrol dan 3 galur mutan padi dari varietas Diah Suci yaitu obs- 1700, obs-1701 dan obs-1704. Bahan lainnya yaitu bacto agar, gula pasir, aquades, media kultur MS, NaCl, ZPT IBA, Chlorox, Tween untuk penyabunan dalam sterilisasi eksplan, spiritus dan alkohol 96. a b c d Gambar 6. a Eksplan Varietas Diah Suci, b Obs.1700, c Obs.1704 dan d Obs.1701

3.2.2 Alat

Alat yang digunakan antara lain Autoclave, Laminar Air Flow Cabinet LAFC, hot plate dan magnetic strirrer + spin bar, oven, microwave, timbangan analitik, pH meter digital, lemari es, botol tanam, alumunium foil, erlenmeyer, karet gelang, beaker glass, gegep, pipet volume, labu ukur, rak kultur yang dilengkapi lampu TL Philips 40 Watt sumber penyinaran, alat-alat diseksi, bunsen, ember plastik, spidol, tisu, kertas label, kereta dorong, dan perlengkapan pencucian alat-alat gelas. a b c d Gambar 7. Alat dalam kultur jaringan diantaranya a Autoclave, b LAFC, c Oven dan d timbangan analitik 3.3 Cara Kerja 3.3.1 Sterilisasi Alat Dalam Laboratorium Kultur Jaringan di BATAN terdapat 2 macam sterilisasi yaitu sterilisasi basah dan sterilisasi kering. Sterilisasi basah dilakukan untuk mensterilisasi media kultur yang sudah dibuat dan botol kultur yang sudah terkontaminasi dengan menggunakan Autoclave. Sedangkan sterilisasi kering dilakukan untuk mensterilkan alat diseksi seperti skalpel, cawan petri, pinset, erlenmeyer dan botol kultur yang akan digunakan dan sudah dicuci bersih dikeringkan dan dibungkus dengan alumunium foil kemudian disterilisasi dalam oven pada suhu 180°C selama 2 jam. Pada saat pemotongan dan penanaman eksplan alat diseksi ini disterilisasi kembali dengan alkohol 96 lalu dibakar di atas pembakar bunsen beberapa saat sebelum digunakan.

3.3.2 Pembuatan Media Kultur

Media dasar yang digunakan dalam penelitian ini adalah media MS. Untuk memudahkan pembuatan media, maka terlebih dahulu dilakukan pembuatan larutan stok. Adapun komposisi senyawa kimia yang terdapat dalam larutan stok terdapat dalam lampiran 2. Pembuatan media secara umum yaitu dimasukkan komposisi media MS yang terdiri dari larutan stok 1 sampai 6 dengan volume larutan stok 1-3 sebanyak 10 ml, stok 4-6 sebanyak 5 ml, konsentrasi NaCl 0, 0.5, 1, dan 1.5, konsentrasi ZPT IBA 0 mgl, 2.5 mgl, dan 5 mgl masing-masing ke dalam gelas beaker 1000 ml kemudian ditambahkan gula pasir sebanyak 20 gr dan dilarutkan dalam 1000 ml aquades, selanjutnya diaduk menggunakan magnetic stirrer supaya homogen. Setelah homogen, dilakukan pengukuran pH media dengan menggunakan pH meter digital. pH media ini yaitu 5.8. Menurut Yusnita 2003, jika larutan media tersebut mempunyai pH yang rendah yaitu kurang dari 4.5 maka larutan media yang terbentuk sangatlah encer. Sedangkan jika larutan media tersebut mempunyai pH yang terlalu tinggi yaitu lebih dari 5.8 maka larutan media akan berbentuk padat. Dalam pembuatan media selain harus memperhatikan ketepatan dalam pempipetan larutan juga harus memperhatikan keasaman media pH larutan. Apabila larutan terlalu asam maka ditambahkan NaOH dan bila terlalu basa ditambahkan HCl. Setelah pH yang dikehendaki tercapai, kemudian media tersebut dimasukkan ke dalam erlenmeyer 250 ml yang berisi pemadat atau bacto agar sebanyak 2 gr. Erlenmeyer ditutup dengan alumunium foil dan diikat dengan karet. Selanjutnya media tersebut di sterilisasi menggunakan autoclave selama 15 menit pada tekanan 1 atm dengan suhu 121 ° C. Media yang telah steril kemudian disimpan di dalam ruang kultur. Penuangan media dilakukan di LAFC yang telah dibersihkan dan disemprot dengan alkohol 96. Setiap media perlakuan dituang ke dalam botol kultur steril. Botol yang telah berisi media kemudian ditutup dengan alumunium foil. Gambar 8. Media MS

3.3.3 Induksi Padi

Induksi padi dilakukan di LAFC dengan terlebih dahulu menyalakan blower dan lampu penerang LAFC minimal selama 15 menit, kemudian seluruh permukaan LAFC dibersihkan dengan tisu dan disemprot dengan alkohol 96. LAFC yang sudah steril langsung digunakan untuk sterilisasi eksplan. Masing- masing eksplan padi dari varietas DS sebagai kontrol dan 3 galur mutan padi obs- 1700, obs-1701 dan obs-1704 dikupas gabahnya kemudian disterilkan dengan menggunakan 100 ml larutan chlorox 40 dan 4 tetes tween yang dihomogenkan selama 25 menit. Setelah itu dibilas dengan air steril sebanyak 3 kali. Eksplan atau biji padi varietas DS, obs.1700, obs.1701 dan obs.1704 yang sudah steril siap untuk di induksi di dalam LAFC. Setelah biji padi varietas DS, obs.1700, obs.1701 dan obs.1704 dalam keadaan steril, selanjutnya skalpel dan pinset juga disterilisasi dengan menggunakan alkohol 96 untuk memotong dan menanam eksplan, lalu dibakar di atas bunsen beberapa saat sebelum digunakan kemudian dinginkan. Selanjutnya biji padi tersebut dipotong menjadi dua bagian yaitu endosperm dan embrio dengan menggunakan skalpel dan pinset steril. Bagian endosperm padi dibuang sedangkan bagian embrio padi ditumbuhkan ke media kultur MS dengan variasi konsentrasi NaCl dan IBA. Embrio padi dari varietas DS sebagai kontrol dan 3 galur mutan padi obs.1700, obs.1701 dan obs.1704 yang sudah dipotong dimasukkan ke dalam botol kultur yang berisi media MS dengan kombinasi NaCl dan IBA, dimana setiap botol kultur berisi 3 buah embrio dari varietas DS dan 3 galur mutan padi obs.1700, obs.1701 dan obs.1704. Botol kultur yang sudah berisi planlet embrio padi diberi kode jenis media, jenis planlet, serta tanggal penanaman kemudian diinkubasi dalam ruang kultur dengan suhu ruang sekitar 26 C-28 C dan diletakkan pada rak yang dilengkapi dengan lampu Philips 40 watt sebagai sumber penyinaran dengan suhu 20 C-24 C. Pengamatan dimulai dari 1 minggu setelah tanam sampai 4 minggu setelah tanam untuk mengetahui persentase daya tumbuh, tinggi dan panjang akar planlet dari padi varietas DS dan 3 galur mutannya yaitu obs.1700, obs.1701 dan obs.1704. Eksplan atau biji padi steril dipotong bagian endosperm dan embrio Gambar 9. Tahapan Induksi Padi

3.4 Parameter Pengamatan

Pengamatan dilakukan dari umur satu minggu setelah tanam sampai empat minggu setelah tanam. Dalam satu minggu, pengamatan dilakukan satu sampai dua kali. Parameter yang diamati adalah: Botol kultur berisi 3 embrio padi Botol kultur berisi 3 embrio padi Ruang Tumbuh, Ruang Tumbuh, penyinaran l penyinaran l ampu Philips ampu Philips 40 Watt dan suhu 20- 40 Watt dan suhu 20- 24 24 o C. C.

1. Persentase Daya Tumbuh Planlet

Planlet hidup adalah meliputi planlet yang tumbuh dan mengalami penghambatan atau penghentian pertumbuhan namun tidak mati. Planlet yang hidup mulai dihitung dari awal sampai akhir pengamatan yaitu umur 4 MST Minggu Setelah Tanam dengan dengan rumus sebagai berikut : daya tumbuh = x 100

2. Tinggi Planlet

Pengukuran tinggi planlet diukur pada umur 2-4 MST. Pengukuran tinggi planlet pada umur 2-3 MST dilakukan dengan cara menggunakan penggaris yang ditempelkan pada dinding botol kultur karena planlet tidak dikeluarkan dari botol kultur dan pengukuran di mulai dari batas batang pokok hingga permukaan atas tanaman. Pengukuran tinggi planlet pada umur 4 MST dilakukan dengan cara planlet dikeluarkan dari botol kultur, dibilas dengan air mengalir kemudian dibentangkan pada penggaris dan diukur tingginya mulai dari batas batang pokok hingga ujung tanaman yang paling panjang.

3. Panjang Akar

Pengamatan dan pengukuran panjang akar dilakukan pada saat tanaman sudah berumur 4 MST. Proses pengukuran dilakukan dengan cara menggunakan penggaris dimana tanaman dikeluarkan dari botol kultur, dibilas dengan air mengalir kemudian dibentangkan pada pengggaris dan diukur panjangnya mulai dari batas batang pokok hingga bulu-bulu akar yang terpanjang. mati - inasi terkontam - ditanam yang planlet jumlah ditanam yang planlet jumlah

3.5 Rancangan Percobaan