©Hak cipta milik IPB, tahun 2007 Hak cipta dilindungi UU
1.
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah
b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar
IPB
2.
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI XILANASE EKSTRASELULER
Streptomyces sp. SKK1-8 ASAL SUKABUMI
NUNUK WIDHYASTUTI
Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada Program Studi Biologi
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2007
HALAMAN PENGESAHAN
Judul : Purifikasi dan Karakterisasi Xilanase Ekstraseluler
Streptomyces sp. SKK1-8 asal Sukabumi
Nama Mahasiswa : Nunuk Widhyastuti
NIM :
G351040101
Disetujui Komisi Pembimbing
Dr. Anja Meryandini MS Ketua
Dr. Ir. Yulin Lestari Anggota
Diketahui Ketua Program Studi Biologi
Dekan Sekolah Pasca Sarjana
Dr. Ir. Dedy Duryadi S. DEA Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, MS
Tanggal Ujian: 30 Juli 2007 Tanggal Lulus :
Penguji Luar Komisi pada Ujian tesis : Prof. Dr. Maggy Thenawijaya Suhartono
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Madiun, Jawa Timur pada tanggal 28 Agustus 1964. Penulis merupakan anak kelima dari delapan bersaudara dari ayah yang bernama
Arianto dan ibu Soetami. Penulis menyelesaikan pendidikan sekolah menengah atas di SMU Negeri 1
Madiun pada tahun 1983. Pada tahun yang sama penulis diterima di jurusan Biologi Lingkungan, Fakultas Biologi, Universitas Gajah Mada, Yogyakarta. Penulis
menyelesaikan studi strata 1 pada tahun 1988. Sejak tahun 1989 hingga saat ini penulis bekerja pada Pusat Penelitian
Biologi-LIPI. Tahun 1989-1992 penulis mendapat tugas di Bidang Jasa dan Informasi ilmiah, dan pada tahun 1993 sampai sekarang penulis adalah staf peneliti di Bidang
Mikrobiologi,
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI XILANASE EKSTRASELULER
Streptomyces sp. SKK1-8 ASAL SUKABUMI
NUNUK WIDHYASTUTI
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2007
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul purifikasi dan karakterisasi xilanase ekstraseluler Streptomyces sp.SKK1-8asal Sukabumi adalah
benar hasil karya sayasendiri denngan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber data dan
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, September
2007
Nunuk Widhyastuti G351040101
ABSTRACT
NUNUK WIDHYASTUTI. G3501040101. Purification and Characterization of Streptomyces
sp SKK1-8 Extracellular Xylanase from Sukabumi. Under the direction of ANJA MERYANDINI and YULIN LESTARI.
Hemicelluloses, consist of mainly xylans, are the second most abundant polysaccharides on earth and renewable organic carbon. Bioconversion of
hemicelluloses by enzymatic process to valuable products has recieved much attention. Xylanase catalyzes the hydrolysis of 1,4-
β-glycosidic bound from xylans into small oligomers and xylose residues. Xylanolytic enzymes and its hydrolysis
products have potential application in various agro-industrial processes such as in the pulp and paper industries, food and chemical industries, agriculture and poultry. This
research was focused on purification and characterization of xylanase from Streptomyces
sp SKK1-8. Selective precipitation and isolation of xylanase were studied using
ammonium sulphate, aceton and anionic polimer eudragit S100. The results indicated that ammonium sulphate and polimer eudragit S100 were not effective for xylanase
precipitation. Therefor, xylanase was precipitated with 50-80 acetone.
Xylanase was purified by the procedures of aceton precipitation, gel filtration Sephadex G100 and anion exchange chromatography DEAE-Sephadex A-50. The
purity of xylanase increased 12.97 fold than those of the crude enzyme. The specific activity after purification was 1.3817 Umg. The purified xylanase contains two
proteins with the estimated molecular weights of 14.4 kDa and 13.4 kDa as shown on native PAGE and SDS-PAGE stained with silver nitrate.
The purified xylanase had different characters from crude xylanase. The activity of purified xylanase was optimal at 50
o
C, pH 4.5. The xylanase maintained its stability at 50
o
C and over pH range from pH 4.0 – 8.5. The activity and stability of the enzyme were influenced by the buffer system used. Strong inhibition of
xylanase activity was observed when Sr
2+
, Ag
2+
and Ba
2+
were added to the enzyme reaction mixture, but Cu
2+
dan Zn
2+
activated the enzyme. The xylanase was capable of hydrolising p-NP-
β-D-xylanopiranoside, p-NP- α-L-arabinofuranoside, p-NP-α-D-
glucopiranoside and p-NP- α-D-galactopiranoside, but not p-NP-acetate. The
capability of hydrolising four kinds of substrates indicated that this purified xylanase had bifungtional activity. The Km and Vmax values at 50
o
C measured on birchwood xylan were 0.101 mgml and 0.1796
μmoles xilosamenitml respectively. Key words : xylanase, Streptomyces, purification, characterization
RINGKASAN
NUNUK WIDHYASTUTI. G3501040101. Purifikasi dan Karakterisasi Xilanase Ekstraseluler Streptomyces sp. SKK1-8 Asal Sukabumi. Dibimbing oleh ANJA
MERYANDINI dan YULIN LESTARI
Hemiselulosa merupakan heteropolimer yang keberadaaannya di alam kedua terbanyak setelah selulosa. Kadar hemiselulosa pada tanaman mencapai 20-30 berat
kering kayu. Saat ini sebagian besar limbah hemiselulosa masih belum dimanfaatkan secara optimal padahal berpotensi untuk diolah menjadi berbagai produk yang lebih
bernilai ekonomi. Komponen utama hemiselulosa adalah xilan yang memiliki tulang punggung rantai D-xilopiranosa dengan ikatan glikosidik
β-1,4. Residu O-asetil, arabinosil dan 4-O-metil asam glukoronat terikat pada tulang punggung xilan. Kadar
dan komposisi xilan pada tanaman bervariasi tergantung pada jenis tanaman. Diperlukan kerja sinergi dari beberapa enzim xilanolitik untuk mendegradasi secara
lengkap struktur xilan yang kompleks menjadi monomernya.
Xilanase merupakan enzim kompleks yang terdiri atas 1,4- β-endoxilanase, β-
xilosidase, α-L-arabinofuranosidase, α-glukuronidase, asetil xilan esterase dan asam
fenolat esterase. Xilanase dan produk hidrolisisnya memiliki potensi untuk diaplikasikan dalam berbagai industri. Xilanase dapat diaplikasikan pada industri
kertas, pangan, peternakan dan pengolahan limbah. Xilitol, furfural, xilooligosakarida dan asam glukuronat merupakan produk hidrolisis xilanase yang berpotensi untuk
diaplikasikan pada industri pangan, farmasi dan kimia.
Xilanase dihasilkan oleh bakteri, cendawan dan khamir. Streptomyces adalah bakteri Gram positif yang membentuk miselium dan telah digunakan untuk
mensintesis senyawa antibiotik, metabolit sekunder lain dan enzim dalam skala industri. Beberapa Streptomyces asal Indonesia diketahui berpotensi sebagai
penghasil xilanase, diantaranya Streptomyces sp. 1141-1, Streptomyces sp. 234P-16, Streptomyces
sp 451-3 dan Streptomyces sp SKK1-8. Xilanase memiliki karakter yang bervariasi. Xilanase bakteri biasanya bersifat
netral sampai alkali sedangkan xilanase cendawan bersifat asam. Pada umumnya suhu optimal xilanase antara 40-60
o
C, namun xilanase beberapa mikroba diketahui bersifat thermostabil. Studi mengenai karakter xilanase perlu dilakukan untuk
mengetahui aplikasi xilanase pada industri yang sesuai. Misalnya xilanase yang digunakan dalam proses bleaching pada industri pulp harus memiliki pH optimum
alkali dan stabil pada pH tersebut, bersifat thermostabil dan tidak terkontaminasi selulase.
Xilanase fraksi aseton Streptomyces sp SKK1-8 memiliki karakter yang menarik sehingga dirasa perlu untuk dilakukan pemurnian Karakter tersebut
diantaranya yaitu reaksi enzimatisnya optimum pada suhu 50
o
C, memiliki aktivitas pada rentang pH yang luas, stabil pada penyimpanan selama 1 bulan dalam
refrigerator dan bebas dari selulase. Xilosa dan arabinosa merupakan produk hidrolisis birchwood xilan oleh xilanase tersebut. Hasil SDS-PAGE dan zimogram
menunjukkan adanya tiga pita xilanase yang berdekatan dengan berat molekul 16.80 kDa, 15.21 kDa dan 13.86 kDa.
Dewasa ini penggunaan polimer Eudragit S100 pada tahap awal pemurnian telah dikembangkan. Eudragit S100 merupakan polimer asam metakrilat dan
metilmetakrilat yang mengalami perubahan kelarutan tergantung dari pH larutan. Pada kondisi di atas pH 5.5 eudragit S100 bersifat larut sedangkan di atas pH
tersebut akan mengendap. Hasil pengujian menunjukkan bahwa Eudragit S100 tidak efektif untuk memisahkan xilanase Streptomyces sp SKK1-8 dari senyawa
pengotornya. Sebanyak 40.6 xilanase tidak terikat oleh polimer tersebut dan hanya 5.9 yang dapat dielusi dengan 0.1 M bufer fosfat pH 7.5 yang mengandung 1M
NaCl dan 0.2 Triton X-100.
Pengendapan xilanase dilakukan dengan menggunakan amonium sulfat dan aseton. Xilanase Streptomyces sp SKK1-8 mengendap maksimal pada konsentrasi
90 amonium sulfat dengan aktivitas sebesar 8.872 Uml dan pemulihan 25. Xilanase yang diendapkan dengan aseton mulai mengendap pada konsentrasi 60
dan maksimal pada konsentrasi 80 dengan aktivitas sebesar 33.606 Uml dan pemulihan 96.
Semipurifikasi xilanase Streptomyces sp SKK1-8 dilakukan dengan filtrasi gel matrik Sephadex G100 dan kromatografi penukar ion matrik DEAE-Sephadex.
A50. Hasil SDS-PAGE dan native PAGE menunjukkan adanya 2 pita protein yang memiliki BM sekitar 43.2 kDa dan 39.2 kDa. Kemurnian xilanase hasil kromatografi
meningkat 12.97 kali dibandingkan aktivitas enzim kasarnya dengan aktivitas spesifik sebesar 1.3817 Umg.
Proses pemurnian merubah sebagian karakter xilanase Streptomyces sp. SKK1-8 sehingga berbeda dengan karakter xilanase hasil pengendapan dengan aseton.
Karakter yang berubah yaitu pH optimum reaksi enzimatis dan pengaruh 1 mM kation terhadap aktivitas xilanase. Xilanase hasil pemurnian memiliki aktivitas
optimum pada pH 4.5 dan suhu 50
o
C, stabil pada rentang pH 4-8.5 dan suhu 50
o
C. Aktivitas dan stabilitas xilanase dipengaruhi baik oleh pH maupun jenis bufer yang
digunakan. Aktivitas xilanase dihambat oleh adanya 1 mM Ag
2+
, Ba
2+
, Ca
2+
, Co
2+
, K
+
, Na
+
dan Sr
2+
, diaktivasi oleh 1 mM Cu
2+
dan Zn
2+
, dan relatif tidak terpengaruh oleh 1 mM Fe
3+
dan Ni
2+
. Nilai Km dan Vmax xilanase pada substrat birchwood xilan berturut-turut yaitu 0.101 mgml dan 0.1796
μMmenitml.
Kata kunci : xilanase, Streptomyces, pemurnian, karakterisasi
©Hak cipta milik IPB, tahun 2007 Hak cipta dilindungi UU
1.
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,