dituang ke dalam kolom kromatografi dan diseimbangkan dengan 10 mM bufer Tris- HCl pH 8.0. Larutan xilanase hasil dialisis dimasukkan ke dalam kolom yang berisi
matrik DEAE-Sephadex A50. Protein yang tidak terikat matrik dibilas dengan bufer yang sama, sedangkan protein yang terikat matrik dibilas dengan gradien linier
larutan NaCl 0-0.5 M NaCl dalam bufer yang sama dan 1 M NaCl. Pembilasan dilakukan dengan kecepatan alir 0.5 mlmenit, setiap 3 ml eluen ditampung, diukur
kadar protein dan diuji aktivitasnya. Dibuat grafik profil elusi dan dilihat kemurniannya dengan elektroforesis.
Elektroforesis dilakukan pada piranti elektroforesis vertikal Mini Protean 3 Bio-Rad pada kondisi protein terdenaturasi SDS-PAGE atau tidak terdenaturasi
native PAGE. Larutan xilanase dari setiap tahap pemurnian dilarikan pada gel poliakrilamida 4 akrilamida pada gel penahan dan 10 akrilamida pada gel
pemisah. Elektroforesis dilakukan pada tegangan 100 volt, 50 mA sampai pewarna bromofenol biru mencapai sekitar 1 cm dari tepi gel bagian bawah. Hasil
elektroforesis diwarnai dengan pewarna Coomasie Brilliant Blue CBB atau pewarna perak nitrat. Fraksi filtrasi gel dan fraksi kromatografi penukar anion dipekatkan 40
kali sebelum dilakukan elektroforesis.
3.3.6 Penghitungan Berat Molekul Xilanase
Penghitungan berat molekul xilanase dilakukan dengan cara membandingkan jarak migrasi pita xilanase dengan pita protein penanda yang memiliki berat molekul
rendah low molecular weight marker. Protein penanda yang digunakan yaitu monoalbumin serum babi, 66 kDa, albumin telur ayam, 45kDa, karbonik
anhidrase 29 kDa dan α-lactalbumin 14.2 kDa. Persamaan linier protein penanda
diperoleh dengan membuat kurva antara Rf dan log berat molekul protein penanda. Perkiraan berat molekul xilanase dihitung dari persamaan linier tersebut.
Rf = jarak migrasi pita protein jarak migrasi bromofenol biru
3.3.7 Pengukuran Kadar Protein
Kadar protein selama pemurnian diukur dengan metode Bradford Bradford 1976 dan absorbansi pada panjang gelombang 280 nm untuk pembuatan
kromatogram. Pengukuran protein dengan metode Bradford dilakukan dengan cara sebagai berikut : sebanyak 0.4 ml larutan enzim ditambah 4 ml reagen Bradford,
dikocok sampai homogen dan diinkubasikan pada suhu kamar selama 15 menit. Diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm.
Bovine Serum Albumine BSA digunakan sebagai standar untuk menghitung kadar
protein larutan enzim.
3.3.8 Pengaruh pH dan Suhu Terhadap Aktivitas dan Stabilitas Xilanase
Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim diuji dengan cara mereaksikan larutan enzim dengan substrat pada suhu 50
o
C selama 30 menit pada berbagai kondisi pH larutan bufer pH 4.0-9.0 dengan selang 0.5 unit. Gula pereduksi yang terbentuk
diukur dengan metode Miller 1959. Stabilitas enzim terhadap pH diuji dengan menginkubasikan larutan enzim dalam 10 mM larutan bufer berbagai pH 3.0-9.0
dengan selang 0.5 unit selama 1 jam. Setelah inkubasi selesai, dengan cepat diuji aktivitas enzim tersisanya pada kondisi optimum reaksi enzim xilanase dengan
konsentrasi larutan bufer sebesar 0.1 M. Nilai aktivitas enzim tersisa dinyatakan dalam persentase dibandingkan dengan kontrol enzim tanpa perlakuan. Bufer yang
digunakan yaitu bufer asetat pH 4.0-6.0, bufer fosfat pH 6.0-8.0 dan bufer Tris- HCl pH 7.0-9.0.
Pengaruh suhu terhadap aktivitas xilanase diuji dengan cara mereaksikan larutan enzim dengan substrat selama 30 menit pada berbagai suhu 40-80
o
C dengan selang 5
o
C. Aktivitas xilanase dihitung dengan mengukur gula pereduksi yang terbentuk. Stabilitas enzim terhadap suhu diuji dengan menginkubasikan larutan
enzim pada berbagai suhu 40-80
o
C dengan selang 10
o
C selama 1 jam. Setelah inkubasi selesai larutan enzim dengan cepat didinginkan di dalam penangas es.
Selanjutnya aktivitas enzim tersisa diuji pada kondisi standar reaksi enzimatis
xilanase. Nilai aktivitas enzim tersisa dinyatakan dalam persentase dibandingkan dengan kontrol enzim tanpa perlakuan
3.3.9 Pengaruh Kation Terhadap Aktivitas Xilanase
