3.3.3 Pengendapan Xilanase Menggunakan Amonium Sulfat dan Aseton
Xilanase diendapkan pada suhu dingin diatas penangas es dengan cara menambahkan amonium sulfat yang telah dihaluskan atau aseton dingin sedikit demi
sedikit ke dalam larutan xilanase kasar sambil diaduk perlahan dengan pengaduk bermagnet sampai mencapai kejenuhan tertentu. Pengadukan dilanjutkan selama 15
menit kemudian larutan disimpan dalam lemari pendingin selama semalam. Endapan yang terbentuk dipisahkan dengan sentrifugasi dan dilarutkan dengan 10 mM bufer
fosfat pH 6.0. Penghitungan banyaknya amonium sulfat atau aseton yang ditambahkan ke dalam larutan enzim diperlihatkan dalam lampiran 4.
Guna memperoleh hasil yang optimal maka pengendapan xilanase Streptomyces
sp. SKK1-8 dilakukan secara bertahap, yaitu dengan 50-80 aseton. Mula-mula aseton ditambahkan pada larutan enzim kasar sampai mencapai
konsentrasi 50, disentrifugasi pada kecepatan 5.000 rpm dan endapan yang merupakan protein pengotor dibuang. Selanjutnya aseton ditambahkan lagi ke dalam
filtrat sampai mencapai konsentrasi 80, disentrifugasi dan filtratnya dibuang. Endapan dilarutkan dengan 0.05M bufer fosfat pH 6.0, disentrifugasi untuk
memisahkan protein tidak larut yang merupakan protein terdenaturasi. Filtrat yang diperoleh dimurnikan lebih lanjut.
3.3.4 Pemisahan Xilanase dengan Polimer Eudragit S100
Preparasi 2 Eudragit S100: 2 gr eudragit S100 ditambah 80 ml akuades, dinaikkan pHnya dengan penambahan 3 M NaOH sampai mencapai pH 11.
Selanjutnya pH diturunkan dengan penambahan 3 M HCl sampai mencapai pH 7.0 dan volume ditepatkan menjadi 100 ml. Larutan disimpan dalam lemari pendingin
sampai digunakan. Pemisahan xilanase dengan eudragit S100 dilakukan berdasarkan metode
yang digunakan oleh Breccia et al. 1998 yang dimodifikasi. Sebanyak 40 ml ekstrak kasar xilanase ditambahkan pada 20 ml 2 eudragit S100, diaduk dengan magnetik
stirer dan diinkubasi pada suhu kamar selama 15 menit. Selanjutnya pH diturunkan dengan penambahan 2 M asam asetat sampai mencapai pH 4.0 dan disentrifugasi
pada kecepatan 5 000 g selama 15 menit. Supernatan disimpan supernatan 1 dan endapan dicuci dengan 10 mM bufer asetat pH 4.0 dan disentrifugasi. Supernatan
disimpan supernatan 2, endapan dilarutkan dengan 14 ml 0.1 M bufer fosfat pH 7.5 kemudian ditambahkan NaCl dan Triton X-100 dengan konsentrasi akhir berturut-
turut 1M dan 0.2. Larutan diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit. Ditambahkan 2 M asam asetat sampai pH mencapai 4.0, didiamkan selama 20 menit
dan disentrifugasi. Supernatan disimpan supernatan 3 dan endapan dilarutkan dalam 1.5 ml 0.1 M bufer fosfat pH 7.5 xilanase terikat eudragit S100. Dilakukan
pengujian aktivitas xilanase pada supernatan 1, 2, 3 dan xilanase terikat eudragit S100 terimobilisasi.
3.3.5 Pemurnian Xilanase
Xilanase dimurnikan dengan menggunakan kromatografi filtrasi gel dan penukar ion. Matrik Sephadex G-100 sebanyak 10 gram dikembangkan dalam 10 mM
bufer fosfat pH 6.0, dipanaskan dalam penangas air mendidih selama 1 jam dan dimasukkan ke dalam lemari pendingin selama semalam. Didekantasi untuk
membuang matrik yang tidak mengendap dan ditambahkan 100 ml larutan bufer yang sama. Matrik dituang ke dalam kolom kromatografi dan diseimbangkan dengan 10
mM bufer fosfat pH 6.0. Selanjutnya dibilas dengan bufer yang sama dengan kecepatan alir 0.5 mlmenit. Setiap 3 ml eluen ditampung, diukur kadar proteinnya
pada panjang gelombang 280 nm dan diukur aktivitas xilanasenya. Dibuat grafik Profil elusi dimana sumbu X merupakan nomor fraksi sedangkan sumbu Y
merupakan nilai kadar protein dan nilai aktivitas xilanase. Fraksi yang mengandung xilanase hasil filtrasi gel digabungkan, dimasukkan ke dalam kantong dialisis
molecular weight cut off 10 000 dan didialisis dengan 10 mM Tris-HCl pH 8.0 dalam lemari pendingin. Selama dialisis bufer diganti sebanyak 2 kali.
Matrik DEAE-Sephadex A50 sebanyak 7 gram dikembangkan dengan 10 mM Tris-HCl pH 8.0, dipanaskan dalam penangas air mendidih selama 1 jam dan
disimpan dalam lemari pendingin selama 1 malam. Didekantasi untuk membuang matrik yang tidak mengendap dan ditambahkan 100 larutan bufer yang sama. Matrik
dituang ke dalam kolom kromatografi dan diseimbangkan dengan 10 mM bufer Tris- HCl pH 8.0. Larutan xilanase hasil dialisis dimasukkan ke dalam kolom yang berisi
matrik DEAE-Sephadex A50. Protein yang tidak terikat matrik dibilas dengan bufer yang sama, sedangkan protein yang terikat matrik dibilas dengan gradien linier
larutan NaCl 0-0.5 M NaCl dalam bufer yang sama dan 1 M NaCl. Pembilasan dilakukan dengan kecepatan alir 0.5 mlmenit, setiap 3 ml eluen ditampung, diukur
kadar protein dan diuji aktivitasnya. Dibuat grafik profil elusi dan dilihat kemurniannya dengan elektroforesis.
Elektroforesis dilakukan pada piranti elektroforesis vertikal Mini Protean 3 Bio-Rad pada kondisi protein terdenaturasi SDS-PAGE atau tidak terdenaturasi
native PAGE. Larutan xilanase dari setiap tahap pemurnian dilarikan pada gel poliakrilamida 4 akrilamida pada gel penahan dan 10 akrilamida pada gel
pemisah. Elektroforesis dilakukan pada tegangan 100 volt, 50 mA sampai pewarna bromofenol biru mencapai sekitar 1 cm dari tepi gel bagian bawah. Hasil
elektroforesis diwarnai dengan pewarna Coomasie Brilliant Blue CBB atau pewarna perak nitrat. Fraksi filtrasi gel dan fraksi kromatografi penukar anion dipekatkan 40
kali sebelum dilakukan elektroforesis.
3.3.6 Penghitungan Berat Molekul Xilanase
Kategori