3.3 Metode Penelitian 3.3.1 Preparasi Larutan Xilanase
Streptomyces sp. SKK1-8 diremajakan pada cawan petri berisi media agar-
agar xilan mengandung 1 ekstrak khamir, 10.3 sukrosa dan 0.5 birchwood xilan, diinkubasi pada suhu kamar selama 4 hari sampai terbentuk spora sporulasi.
Sebanyak 3 cockborer kultur padat Streptomyces sp SKK1-8 tersebut diinokulasikan ke dalam erlenmeyer yang berisi 100 ml media cair xilan, diinkubasikan pada suhu
kamar selama 10 hari dengan pengocokan 150 rpm. Kultur cair disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4
o
C. Filtrat yang diperoleh dipisahkan dari endapan dan digunakan sebagai ekstrak kasar xilanase.
3.3.2 Pengujian Aktivitas Xilanase
Aktivitas xilanase diukur dengan mendeteksi gula pereduksi sebagai produk hidrolisa xilan oleh xilanase menggunakan metode Miller Miller 1959. Sebanyak
100µl larutan enzim ditambahkan pada campuran 1 ml substrat 0.5 birchwood xilan dalam 100 mM bufer fosfat pH 6.0 dan 0.9 ml larutan bufer fosfat 100 mM,
pH 6.0, diinkubasikan pada suhu 50
o
C selama 30 menit. Reaksi enzimatis diakhiri dengan penambahan 2 ml reagen DNS asam dinitrosalisilat dan dipanaskan dalam
air mendidih selama 15 menit. Campuran reaksi didinginkan dan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Kontrol
dibuat dengan cara yang sama seperti pengujian aktivitas xilanase akan tetapi larutan enzim ditambahkan setelah penambahan reagen DNS. Blanko dibuat dengan cara
yang sama akan tetapi larutan enzim diganti dengan 100µl akuades. Xilosa digunakan sebagai standar untuk penghitungan aktivitas xilanase. Satu unit aktivitas xilanase
dinyatakan sebagai banyaknya enzim yang diperlukan untuk menghasilkan 1 µmol gula xilosa dari substrat birchwood xilan permenit pada kondisi seperti tersebut di
atas suhu 50
o
C, pH 6.0.
3.3.3 Pengendapan Xilanase Menggunakan Amonium Sulfat dan Aseton
Xilanase diendapkan pada suhu dingin diatas penangas es dengan cara menambahkan amonium sulfat yang telah dihaluskan atau aseton dingin sedikit demi
sedikit ke dalam larutan xilanase kasar sambil diaduk perlahan dengan pengaduk bermagnet sampai mencapai kejenuhan tertentu. Pengadukan dilanjutkan selama 15
menit kemudian larutan disimpan dalam lemari pendingin selama semalam. Endapan yang terbentuk dipisahkan dengan sentrifugasi dan dilarutkan dengan 10 mM bufer
fosfat pH 6.0. Penghitungan banyaknya amonium sulfat atau aseton yang ditambahkan ke dalam larutan enzim diperlihatkan dalam lampiran 4.
Guna memperoleh hasil yang optimal maka pengendapan xilanase Streptomyces
sp. SKK1-8 dilakukan secara bertahap, yaitu dengan 50-80 aseton. Mula-mula aseton ditambahkan pada larutan enzim kasar sampai mencapai
konsentrasi 50, disentrifugasi pada kecepatan 5.000 rpm dan endapan yang merupakan protein pengotor dibuang. Selanjutnya aseton ditambahkan lagi ke dalam
filtrat sampai mencapai konsentrasi 80, disentrifugasi dan filtratnya dibuang. Endapan dilarutkan dengan 0.05M bufer fosfat pH 6.0, disentrifugasi untuk
memisahkan protein tidak larut yang merupakan protein terdenaturasi. Filtrat yang diperoleh dimurnikan lebih lanjut.
3.3.4 Pemisahan Xilanase dengan Polimer Eudragit S100
