Polimer anionik eudragit S100 dilaporkan dapat digunakan untuk memisahkan xilanase dari protein lain. Xilanase tersebut diantaranya yaitu xilanase Trichoderma
viridae yang meningkat kemurniannya menjadi 4.2 kali Gupta et al. 1994. Xilanase
Bacillus amyloliquefaciens MIR 37 Breccia et al 1998, xilanase Aspergillus sp 5,
Aspergillus sp 44 Gawande Kamat 1999, dan A. niger Sardar et al. 1997 yang
meningkat kemurniannya berturut-turut sebesar 10.8, 4.8 dan 65 kali.
4.2.4 Pemurnian Xilanase dengan Filtrasi Gel dan Kromatografi Penukar
Anion
Profil elusi filtrasi gel memperlihatkan bahwa xilanase dapat dipisahkan dari 2 protein pengotor lainnya namun tidak dapat memisahkan xilanase satu dengan
lainnya. Hal ini ditunjukkan dengan adanya satu puncak protein fraksi 5-23 yang memiliki 2 puncak aktivitas xilanase fraksi 5-11 dan fraksi 15-18. Fraksi 15-18
yang merupakan puncak protein memiliki aktivitas xilanase jauh lebih rendah dari pada fraksi 5-11. Rendahnya aktivitas xilanase pada puncak protein menunjukkan
bahwa pada fraksi tersebut masih terdapat protein-protein lain yang memiliki berat molekul yang besarnya relatif sama dengan xilanase. Menurut Subramaniyan
Prema 2002, mikroba xilanolitik juga menghasilkan enzim lain seperti protease, endoglukanase, selobiohidrolase selain xilanase jika ditumbuhkan pada medium
yang mengandung xilan. Ambarawati 2005 menyatakan bahwa selain menghasilkan xilanase, Streptomyces sp. galur 451-3 juga menghasilkan mananase jika
ditumbuhkan pada media yang mengandung birchwood xilan. Hasil zimogram fraksi aseton menunjukkan adanya 3 xilanase yang memiliki
berat molekul berdekatan Hendarwin 2006, sedangkan pada profil elusi filtrasi gel hanya terdeteksi 2 puncak aktivitas xilanase. Terdapat kemungkinan bahwa dua
xilanase terelusi bersamaan sehingga aktivitasnya berhimpitan dengan aktivitas xilanase lainnya sehingga hanya 2 puncak aktivitas xilanase yang tampak.
Kemungkinan lainnya yaitu berinteraksinya salah satu xilanase dengan matrik Sephadex dan tidakbelum terelusi oleh bufer. Magnuson Crawford 1997
menyatakan bahwa sebagian besar xilanase S. viridosporus T7A hilang selama proses
pemurnian yang terjadi terutama pada tahap filtrasi gel dengan matrik Sephadex G75. Hal ini disebabkan adanya interaksi xilanase dengan tulang punggung Sephadex dan
interaksi tersebut tidak dapat dihindarkan meskipun dilakukan penambahan 0.5 M NaCl pada bufer elusi. Interaksi antara protein selulase Thermotaga maritima dengan
matrik filtrasi gel disebabkan oleh interaksi hidrofobik antara matrik polisakarida dengan residu asam amino pada cellulose binding domain Bronnenmeier et al.
1995. Kemungkinan adanya interaksi antara xilanase dengan matrik filtrasi gel juga disebutkan oleh Lin et al. 1999. Hal ini mungkin terjadi karena xilanase memiliki
carbohydrate binding domain .
Profil elusi kromatografi penukar anion dengan matrik DEAE-Sephadex A50 memperlihatkan adanya 2 protein pengotor yang tidak terikat matrik dan xilanase
yang terikat matrik. Elusi dengan gradien linier 0-0.5 NaCl dalam 10 mM bufer Tris- HCl dapat melepaskan ikatan xilanase dengan matrik. Xilanase hasil kromatografi
penukar anion memiliki tingkat kemurnian 12.97 kali dibanding aktivitas enzim kasar dengan aktivitas spesifik sebesar 1.3817 Umg.
Xilanase dari genus Streptomyces pada umumnya dimurnikan dengan menggunakan teknik kromatografi dan memberikan hasil yang bervariasi. Xilanase S.
achromogenes ISP 5028, S. longisporus rubes IMMAS AS 4-167 dan Streptomyces
sp.IAUR 8812 hasil pemurnian dengan kromatografi penukar anion dan filtrasi gel memiliki tingkat kemurnian dan hasil sebesar 14.7, 4.2, 3.9 dan 8.4, 12.1, 41.8
berturut-turut Belfaquih et al. 2002. Empat xilanase dari S. actuosus yang dimurnikan melalui proses pengendapan amonium sulfat, filtrasi gel Sephacryl S-
200 dan kromatografi penukar kation CM-Sepharose CL-6B memiliki tingkat kemurnian antara 14-62 dan tingkat pemulihan antara 4-11.3 Wang et al. 2003.
Xilanase S. viridosporus T7A hasil pemurnian dengan penukar anion Q-Sepharose, filtrasi gel Sephadex dan isoelectric focusing memiliki tingkat kemurnian tinggi
tetapi hasilnya rendah Magnuson Crawford 1997. Hasil native PAGE dan SDS-PAGE dari fraksi kromatografi penukar anion
xilanase Streptomyces sp SKK1-8 menunjukkan adanya dua pita protein yang letaknya berdekatan dengan berat molekul masing-masing sebesar 14.4 kDa dan 13.4
kDa. Hal ini menunjukkan bahwa xilanase Streptomyces sp SKK1-8 belum dapat dimurnikan sampai tahap kromatografi penukar anion sehingga diperlukan proses
pemurnian lebih lanjut. Untuk itu perlu digunakan teknik yang dapat memisahkan campuran protein dengan berat molekul dan keelektronegatifan yang berdekatan.
Xilanase dari genus Streptomyces memiliki berat molekul yang beragam dan dikelompokkan menjadi xilanase BM tinggi 30 kDa dengan pI rendah dan xilanase
BM rendah 30 kDa dengan pI tinggi. Streptomyces sp. S38 menghasilkan 3 xilanase dengan BM masing-masing sebesar 24.5 kDa, 37.5 kDa dan 38 kDa dengan
pI 9.8, 5.2 dan 4.7 Gories et al. 2000. Namun beberapa xilanase tidak sesuai dengan sistem pengelompokan tersebut, misalnya xilanase S. viridosporus yang memiliki BM
59 kDa dengan pI 10.2 Magnuson Crawford 1997. Xilanase Streptomyces sp SKK1-8 memiliki BM rendah, tetapi belum diketahui pInya sehingga perlu dilakukan
penelitian lebih lanjut untuk mengetahui pI dari xilanase tersebut. Terdapat kemungkinan bahwa pI xilanase tersebut lebih rendah dari pH 7.0. Hal ini mengingat
bahwa pada pH 7.0 hampir setengah dari xilanase yang terdapat pada larutan xilanase kasar tidak terikat polimer anionik eudragit S100 bermuatan negatif yang berarti
xilanase juga bermuatan negatif.
4.2.5 Karakterisasi Xilanase
