filtratnya cukup dilakukan dengan dekantasi. Hasil pengendapan menunjukkan bahwa xilanase tidak mengendap sampai konsentrasi aseton mencapai 50, mulai
mengendap pada konsentrasi 60 dengan aktivitas sebesar 5.762 Uml dan maksimal pada konsentrasi 80 dengan aktivitas sebesar 33.606 Uml. Tidak terdeteksinya
aktivitas xilanase pada konsentrasi 90 aseton dan recovery pemulihan aktivitas xilanase sebesar 96 pada 80 aseton menunjukkan bahwa xilanase sebagian besar
telah mengendap pada 80 aseton. Aktivitas xilanase hasil pengendapan 80 aseton meningkat 4.8 kali dibandingkan dengan larutan enzim kasar 7.015 Uml.
4.1.3 Pemisahan Xilanase dengan Polimer Eudragit S100
Pemisahan xilanase dari protein pengotor lain juga dilakukan dengan menggunakan eudragit S100, suatu polimer anionik metil metakrilat:asam metakrilat
=2:1 yang kelarutannya dipengaruhi oleh pH larutan. Hasil pengujian aktivitas xilanase diperlihatkan dalam Tabel 1. Aktivitas xilanase yang terdeteksi pada
supernatan 1 dan 2 merupakan xilanase yang tidak terikat polimer. Aktivitas xilanase pada elusi merupakan xilanase yang dapat diikat oleh polimer dan terelusi dengan
larutan bufer yang mengandung 1 M NaCl dan 0.2 triton X-100. Aktivitas pada endapan merupakan xilanase yang terimobilisasi polimer eudragit S100. Hasil
pengujian menunjukkan bahwa sekitar 40.6 xilanase tidak terikat eudragit S100 Supernatan 1 dan 2 , hanya 5.9 yang dapat dipisahkan elusi dan 2.86
terimobilisasi pada polimer.
Tabel 2 Aktivitas xilanase hasil pemisahan dengan eudragit S100 Tahap
Aktv. Xilanase Uml
Volume ml
Aktv. Xilanase Total U
Hasil Ekstrak kasar
4.580 40
183.200 100
Supernatan 1 0.939
70 65.730
35.88 Supernatan 2
0.866 10
8.660 4.73
Elusi 0.433 20
10.825 5.91
Endapan 3.495
1.5 5.243
2.86
4.1.4 Pemurnian Xilanase dengan Filtrasi Gel dan Kromatografi Penukar
Anion
Profil elusi filtrasi gel menggunakan matrik Sephadex G-100 memperlihatkan adanya satu puncak protein utama yang terelusi pada fraksi 5-23 mendahului dua
puncak protein kecil lainnya fraksi 31-32 dan fraksi 39. Hasil pengujian aktivitas xilanase menunjukkan adanya 2 puncak aktivitas dimana aktivitas yang lebih tinggi
terdapat pada fraksi 5-11, sedangkan puncak protein fraksi 15-18 menunjukkan aktivitas yang lebih rendah Gambar 6. Fraksi 5-11 digabungkan, diuji
kemurniannya dengan SDS-PAGE dan dimurnikan lebih lanjut. Hasil SDS-PAGE dari fraksi tersebut yang diwarnai dengan CBB memperlihatkan masih ada 3 pita
yang menunjukkan bahwa xilanase belum murni data tidak ditunjukkan.
0.5 1
1.5 2
2.5 3
3.5
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45
No Fraksi OD
2 80
n m
Protein 280nm Aktv xilanase Uml
Gambar 6 Profil elusi filtrasi gel dengan matrik Sephadex G-100 dari xilanase. Elusi menggunakan 10 mM bufer fosfat pH 6.0, kecepatan aliran 0.5
mlmnt. 1
2 3
Fraksi filtrasi gel didialisis menggunakan 10 mM bufer Tris-HCl pH 8.0 dan dimasukkan ke dalam kolom kromatografi penukar anion yang berisi matrik DEAE-
Sephadex A50. Elusi protein tak terikat matrik menggunakan 10 mM bufer Tris-HCl pH 8.0 fraksi 1-30, elusi protein terikat matrik menggunakan gradien linier larutan
0-0.5 M NaCl fraksi 31-90 dan 1 M NaCl fraksi 91-120 dalam 10 mM bufer Tris- HCl pH 8.0. Profil elusi Kromatografi penukar anion Gambar 7 memperlihatkan
adanya 2 puncak protein tidak terikat matrik puncak 1 dan 2 dan dua puncak protein yang tidak terpisah dengan baik puncak 3 dan 4 terelusi dengan gradien linier 0-
0.5M NaCl. Hasil pengujian aktivitas xilanase menunjukkan adanya 1 puncak aktivitas pada fraksi 52-59. Fraksi tersebut digabungkan dan dilihat kemurniannya
dengan SDS-PAGE dan native PAGE.
0.05 0.1
0.15 0.2
0.25
1 9
17 25
33 41
49 57
65 73
81 89
97 105 113
No Fraksi O
D 280nm
Protein OD280nm Aktv xilanase Uml
Gambar 7 Profil elusi kromatografi pertukaran ion dengan matrik DEAE-Sephadex A50 dari xilanase. Elusi menggunakan 10 mM bufer Tris-HCl pH 8.0
fraksi 1-30, gradien linier 0-0.5 M NaCl fraksi 31-90 dan 1M NaCl fraksi 91- 120.
1 2
3 4
A B
Gambar 8 Profil hasil native PAGE A dan SDS-PAGE B dari xilanase. 1 dan 6 marker, 2 xilanase kasar, 3 fraksi aseton, 4 dan 5 fraksi penukar
ion.
Hasil native PAGE yang diberi pewarna perak nitrat menunjukkan bahwa di dalam larutan xilanase kasar Streptomyces sp. SKK1-8 terdapat berbagai protein
dengan berat molekul bervariasi sumur 2. Tampaknya pengendapan xilanase dengan 50-80 aseton sumur 3 tidak banyak menghilangkan protein kontaminan tetapi
meningkatkan konsentrasi protein termasuk xilanase 2 pita protein yang bergerak paling jauh. Hal ini terlihat dengan makin tebalnya pita pada sumur 3 dibandingkan
pita pada sumur 2. Semakin tebal pita hasil elektroforesis menunjukkan bahwa konsentrasi protein semakin tinggi. Hasil native PAGE dan SDS-PAGE dari fraksi
kromatografi penukar ion memperlihatkan adanya 2 pita yang sangat berdekatan dengan berat molekul masing-masing sebesar 14.4 kDa dan 13.4 kDa Gambar 8.
Tampaknya filtrasi gel dengan matrik Sephadex G100 dan kromatografi penukar ion dengan matrik DEAE-Sephadex A50 cukup efektif untuk memisahkan xilanase dari
protein lainnya, meskipun belum dapat memisahkan dua xilanase. Pemurnian xilanase Streptomyces sp. SKK1-8 dari larutan enzim kasar sampai
kromatografi penukar anion dirangkum dalam Tabel 3. Xilanase setelah kromatografi penukar anion memiliki tingkat kemurnian 12.97 kali dibandingkan larutan enzim
kasarnya dengan hasil 48.42. Protein total mengalami penurunan sedangkan aktivitas spesifik mengalami peningkatan seiring dengan proses pemurnian.
1 2
3 4
5 6
Tabel 3 Tahap permurnian xilanase Streptomyces sp. SKK1-8 Tahap
Total Aktv U
Total protein mg
Aktv spesifik Umg
Hasil Tingkat
kemurnian Enzim kasar
285.6 2680.8
0.1065 100
1 Aseton 50-80
62.61 241.731
0.4418 21.92
2.53 Filtrasi Gel
140.55 224.138
0.6271 49.21
5.88 Penukar Anion
138.3 100.095
1.3817 48.42
12.97
4.1.5 Karakterisasi Xilanase
