kDa. Hal ini menunjukkan bahwa xilanase Streptomyces sp SKK1-8 belum dapat dimurnikan sampai tahap kromatografi penukar anion sehingga diperlukan proses
pemurnian lebih lanjut. Untuk itu perlu digunakan teknik yang dapat memisahkan campuran protein dengan berat molekul dan keelektronegatifan yang berdekatan.
Xilanase dari genus Streptomyces memiliki berat molekul yang beragam dan dikelompokkan menjadi xilanase BM tinggi 30 kDa dengan pI rendah dan xilanase
BM rendah 30 kDa dengan pI tinggi. Streptomyces sp. S38 menghasilkan 3 xilanase dengan BM masing-masing sebesar 24.5 kDa, 37.5 kDa dan 38 kDa dengan
pI 9.8, 5.2 dan 4.7 Gories et al. 2000. Namun beberapa xilanase tidak sesuai dengan sistem pengelompokan tersebut, misalnya xilanase S. viridosporus yang memiliki BM
59 kDa dengan pI 10.2 Magnuson Crawford 1997. Xilanase Streptomyces sp SKK1-8 memiliki BM rendah, tetapi belum diketahui pInya sehingga perlu dilakukan
penelitian lebih lanjut untuk mengetahui pI dari xilanase tersebut. Terdapat kemungkinan bahwa pI xilanase tersebut lebih rendah dari pH 7.0. Hal ini mengingat
bahwa pada pH 7.0 hampir setengah dari xilanase yang terdapat pada larutan xilanase kasar tidak terikat polimer anionik eudragit S100 bermuatan negatif yang berarti
xilanase juga bermuatan negatif.
4.2.5 Karakterisasi Xilanase
Profil pengaruh pH terhadap aktivitas xilanase Streptomyces SKK1-8 menunjukkan aktivitas tertinggi pada pH 4.5 dan adanya aktivitas yang cukup tinggi
pada pH 7.0 Gambar 9. Adanya aktivitas pada dua daerah pH tersebut kemungkinan karena masih adanya dua protein dari hasil kromatografi penukar anion,
sesuai dengan hasil elektroforesis yang menunjukkan adanya 2 pita berdekatan Gambar 8. Hal ini sedikit berbeda dengan xilanase Streptomyces SKK1-8 hasil
pengendapan aseton yang menunjukkan aktivitas tertinggi pada pH 6.0 dan aktivitas cukup tinggi pada pH 3.0, 7.2 dan 8.5. Hasil zimogramnya memperlihatkan adanya
tiga xilanase Meryandini et al. 2006. Perbedaan tersebut kemungkinan karena perbedaan jumlah xilanase yang terdapat dalam larutan enzim dan jenis bufer yang
digunakan dalam pengujian. Berbagai penelitian menunjukkan bahwa xilanase dari
genus Streptomyces memiliki aktivitas optimal pada pH yang bervariasi dan memiliki stabilitas pada kisaran pH yang luas, yaitu dari asam sampai basa.
Streptomyces sp strain S38 menghasilkan 3 jenis xilanase yang memiliki aktivitas
optimal antara pH 6.0-8.0 dan stabil pada pH 3.0-10.0 setelah inkubasi pada suhu 20
o
C selama 7 hari Georis et al. 2000. Xilanase Streptomyces T7 memiliki aktivitas optimum pada pH 4.5-5.0 dan stabil pada pH 5.0 Beg et al. 2001. Xilanase S.
Galbus NR memiliki aktivitas optimum pada pH 6.5 dan stabil pada pH 5.0-8.0
setelah inkubasi pada suhu 4
o
C selama 1 jam Kansoh Nagieb 2004. Menurunnya aktivitas enzim karena perubahan pH larutan yang tidak terlalu
besar sedikit dibawah atau diatas pH optimalnya disebabkan oleh berubahnya keadaan ion enzim dan seringkali juga keadaan ion substrat. Perubahan kondisi ion
enzim dapat terjadi pada residu asam amino yang berfungsi katalitik mengikat substrat maupun pada residu asam amino yang berfungsi untuk mempertahankan
struktur tersier dan kwartener enzim yang aktif. Aktivitas enzim yang mengalami penurunan tersebut dapat dipulihkan kembali dengan merubah kondisi reaksi
enzimatis pada pH optimalnya. Pada pH tertentu perubahan muatan ion pada rantai samping yang dapat terionisasi dari residu asam amino enzim menjadi terlalu besar
sehingga mengakibatkan terjadinya denaturasi enzim yang disertai dengan hilangnya aktivitas katalitik enzim. Disamping itu, perubahan struktur tersier menyebabkan
kelompok hidrofobik yang pada mulanya tersembunyi dibagian dalam molekul enzim kontak dengan air sehingga solubilitas enzim menjadi berkurang.
Berkurangnya solubilitas enzim dapat mengakibatkan turunnya aktivitas enzim secara bertahap Palmer 1981, Harper 1984.
X
ilanase Streptomyces sp. SKK1-8 menunjukkan aktivitas dan stabilitas yang berbeda dalam jenis bufer yang berbeda Gambar 9 dan 10. Tampaknya aktivitas dan
stabilitas xilanase tersebut dipengaruhi baik oleh pH maupun jenis bufer. Pada pH 6.0, aktivitas xilanase dalam bufer asetat lebih tinggi dibandingkan dalam bufer fosfat,
sedangkan pada pH 7.0 aktivitas dalam bufer fosfat dua kali lipat aktivitasnya dalam bufer Tris-HCl. Hal ini menunjukkan bahwa jenis bufer berpengaruh terhadap
aktivitas xilanase. Pengaruh pH terhadap aktivitas xilanase juga dijumpai pada
xilanase Cellulomonas flavigena dan Thermotoga maritima. Aktivitas xilanase Cellulomonas flavigena
pada pH 6.5 pH optimumnya dalam bufer sitrat-fosfat lebih tinggi 45 dibandingkan dalam bufer Tris-HCl Martinez-Trujilo et al. 2003.
Aktivitas relatif xilanase Thermotoga maritima pada pH 5.0 dalam bufer asetat sekitar 7 kali lipat dibandingkan aktivitasnya dalam bufer MES, namun pada pH 5.5
aktivitas relatifnya hanya 20 lebih tinggi. Pada pH 7.0 aktivitas relatif xilanase dalam 3 jenis bufer fosfat, Tris-HCl dan CHES menunjukkan nilai yang berbeda
Zhengqiang et al. 2001. Perbedaan aktivitas dalam jenis bufer yang berbeda dikarenakan perbedaan pK bufer, jenis dan jumlah muatan ion komponen bufer.
Setiap jenis bufer memiliki rentang pH tertentu dan kapasitas bufernya dipengaruhi oleh pKnya. Bufer bekerja dengan baik pada daerah pH yang dekat dengan pKnya,
semakin jauh dari pK maka kapasitas bufernya semakin menurun. Muatan ion berpengaruh pada konstanta dielektrik larutan dan jumlah muatan ion berpengaruh
terhadap besarnya kekuatan ion larutan. Konstanta dielektrik dan kekuatan ion berpengaruh terhadap kecepatan reaksi enzimatis Suhartono 1989.
Xilanase Streptomyces sp. SKK1-8 memiliki suhu optimum dan stabil pada suhu 50
o
C setelah inkubasi selama 1 jam. Aktivitas xilanase menurun drastis pada suhu 60
o
C dan kehilangan seluruh aktivitasnya pada suhu 70
o
C. Penelitian Meryandini et al. 2006 menunjukkan hasil yang serupa kecuali pada suhu 70
o
C xilanase Streptomyces sp. SKK1-8 hasil pengendapan dengan aseton masih memiliki
sekitar 20 aktivitas optimalnya sampai suhu 90
o
C. Xilanase yang dihasilkan oleh genus Streptomyces memiliki suhu optimum dan stabilitas yang bervariasi, namun
pada umumnya optimum dan stabil pada suhu 50-75
o
C Beg et al. 2001. Xilanase hasil penelitian ini menyerupai xilanase S. galbus Nr yang memiliki aktivitas
optimum dan stabil sampai suhu 50
o
C setelah preinkubasi selama 30 menit, dan kehilangan aktivitasnya pada suhu yang lebih tinggi Kansoh Nagieb 2004.
Streptomyces sp. strain S38 menghasilkan 3 jenis xilanase yang memiliki aktivitas
optimum pada suhu 55-60
o
C, tetapi Xyl3 lebih stabil dibandingkan Xyl1 dan Xyl2 dimana Xyl3 masih menyisakan lebih dari 80 aktivitasnya setelah preinkubasi
selama 15 menit pada suhu 60
o
C Georis et al. 2000.
Peningkatan aktivitas enzim dibawah suhu optimum disebabkan meningkatnya energi kinetika karena kenaikan suhu reaksi yang mempercepat gerak
vibrasi, translasi dan rotasi dari molekul-molekul yang bereaksi enzim dan substrat sehingga memperbesar frekuensi tumbukan yang merupakan peluang keduanya untuk
bereaksi. Menurunnya aktivitas enzim diatas suhu optimal disebabkan terputusnya ikatan sekunder enzim karena besarnya energi kinetika dari molekul-molekul enzim
melampaui penghalang energi yang mempertahankan ikatan tersebut. Putusnya ikatan sekunder yang mempertahankan struktur enzim dalam keadaan katalitik aktif ini
mengakibatkan hilangnya struktur sekunder dan tersier dari enzim yang disertai dengan berkurangnya atau hilangnya aktivitas enzimatisnya. Pada suhu yang tinggi
substrat dapat mengalami perubahan konformasi sehingga mengalami hambatan dalam “memasuki” sisi aktif enzim Harper 1984; Suhartono 1989.
Pengaruh kation terhadap aktivitas xilanase merupakan parameter penting yang harus diuji mengingat bahwa pada aplikasi enzim sering kali dijumpai adanya
kation dalam konsentrasi rendah yang dapat menghambatmeningkatkan aktivitas enzim. Xilanase Streptomyces sp SKK1-8 hasil pemurnian dihambat aktivitasnya oleh
Ag
2+
, Ba
2+
, Ca
2+
, Co
2+
, K
+
, Na
+
dan Sr
2+
, diaktivasi oleh Cu
2+
dan Zn
2+
, sedangkan Fe
3+
dan Ni
2+
relatif tidak berpengaruh. Hal ini berbeda dengan hasil penelitian Meryandini et al. 2006 yang menunjukkan bahwa ion Fe
2+
, Mg
2+
, Ca
2+
, Cu
2+
, Co
2+
dan Zn
2+
pada konsentrasi 1 mM relatif tidak berpengaruh terhadap aktivitas xilanase Streptomyces
sp. SKK1-8 yang diendapkan dengan aseton. Perbedaan tersebut kemungkinan dikarenakan telah hilangnya sebagian protein dan senyawa kontaminan
lain yang berperan dalam pengikatan ion selama proses pemurnian. Hasil elektroforesis fraksi aseton memperlihatkan adanya beberapa protein lain selain
xilanase. Terdapat kemungkinan bahwa protein-protein tersebut berperan dalam pengikatan kation sehingga aktivitas xilanase fraksi aseton relatif tidak terpengaruh
dengan adanya 1 mM berbagai kation. Hasil elektroforesis fraksi kromatografi penukar anion menunjukkan protein lain telah hilang dan hanya ada dua pita protein
yang diduga sebagai xilanase. Kation akan terikat pada xilanase dan mengakibatkan aktivitasnya berubah meningkat atau menurun.
Jenis ion yang bersifat menghambat atau meningkatkan aktivitas berbeda untuk setiap enzim dan sumber enzim. Xilanase Penicillium capsulatum terhambat
aktivitasnya oleh sebagian besar ion yang diujikan dengan efek penghambatan sebesar 21-86 Ryan et al. 2003, sebaliknya xilanase Bacillus polymixa tidak
terpengaruh oleh kebanyakan ion, terhambat sebagian oleh Cu
2+
dan meningkat dengan adanya Mg
2+
Morales et al, 1995. Xilanase S. viridosporus T7A tidak terhambat oleh beberapa ion tetapi terhambat oleh ion Hg
2+
, Fe
2+
, Cu
2+
, dan K
+
Magnuson Crawford 1997. Xilanase cendawan Humicola insolens aktivitasnya tidak terpengaruh oleh keberadaan 1mM beberapa ion kecuali ion Mn
2+
dan Hg
2+
Düsterhöft et al. 1997. Ion Mn
2+
pada umumnya menghambat aktivitas xilanase, namun pada xilanase S. actuosus A-151, Bacillus sp. strain SPS-0 dan B.
amyloliquefaciens justru meningkatkan aktivitasnya Wang et al. 2003.
Interaksi ion dengan residu asam amino yang terdapat pada sisi aktif dapat mengakibatkan berubahnya afinitas enzim terhadap substrat meningkat atau
menurun, sedangkan interaksi ion dengan residu asam amino yang mempertahankan konformasi aktif enzim mengakibatkan berubahnya konformasi enzim menjadi lebih
aktif atau nonaktif. Ion Hg
2+
menghambat aktivitas enzim dengan cara berikatan dengan asam amino triptofan yang terdapat pada sisi aktif enzim Wang et al. 2003.
Asam amino aromatik diketahui terdapat pada sisi aktif xilanase dalam jumlah cukup banyak dengan posisi berjajar dan berfungsi dalam pengikatan substrat Tahir et al.
2002. Beberapa jenis ion diduga berinteraksi dengan residu asam amino asam Glu yang berada pada sisi aktif yang mengakibatkan penurunan aktivitas xilanase
Magnuson Crawford 1997. Dua residu asam amino glutamat yang letaknya saling berhadapan terdapat pada sisi aktif xilanase diketahui berfungsi sebagai nukleofilik
dan katalis asambasa Tahir et al. 2002. Aktivitas
xilanase Streptomyces
sp. SKK1-8 mengalami penurunan 33 dengan adanya 1mM EDTA. Penurunan aktivitas karena adanya senyawa EDTA juga
dilaporkan terjadi pada beberapa xilanase dengan efek penghambatan bervariasi. Aktivitas xilanase Streptomyces galbus NR turun 22 dengan adanya 1mM EDTA
Kansoh Nagieb 2004. Senyawa EDTA merupakan inhibitor kuat enzim yang
mengikat ion logam pada sisi aktifnya karena EDTA dapat mengkelat logam tersebut sehingga enzim kehilangan aktivitasnya. Namun EDTA hanya sedikit menghambat
enzim-enzim yang tidak memiliki logam pada sisi aktifnya, seperti xilanase Zhengqiang et al. 2001. Penghambatan EDTA pada enzim yang tidak mengandung
logam pada sisi aktifnya lebih dikarenakan pada berubahnya konformasi protein karena hilangnya logam yang berfungsi dalam mempertahankan struktur protein.
Xilanase Streptomyces
sp SKK1-8 dapat memecah substrat p-NP- β-D-
xilanopiranosida, p-NP- α-L-arabinofuranosida, p-NP-α-D-glukopiranosida dan p-NP-
α-D-galaktopiranosida. Dapat dikatakan bahwa xilanase tersebut memiliki aktivitas endoxilanase,
α-L-arabinofuranosidase, α-D-glukuronidase, dan
α-D- galaktopiranosidase. Kemampuan xilanase menghidrolisa lebih dari satu substrat
kemungkinan karena masih adanya 2 protein seperti ditunjukkan oleh hasil native PAGE yang diduga sebagai xilanase dan adanya lebih dari satu aktivitas pada
masing-masing xilanase bifungsional. Sifat bifungsional juga telah dilaporkan pada beberapa xilanase mikroba.
Menurut Wong et al. 1988, kebanyakan xilanase murni hanya memiliki satu aktivitas, namun beberapa lignoselulolitik enzim dilaporkan memiliki spesifisitas
substrat yang luas. Semula diduga hal itu disebabkan ketidak murnian enzim dan substratnya. Namun penelitian lebih mendalam menunjukkan bahwa beberapa enzim
yang dimasukkan dalam famili 16, 52 dan 62 merupakan enzim bifungsional yang memiliki 2 katalitik domain dimana salah satunya merupakan katalitik domain dari
xilanase famili 10 atau 11 Collins 2005. Xilanase juga diketahui memiliki aktivitas lain selain aktivitas xilosidase. Xilanase Clostridium stercorarium mampu
menghidrolisis substrat p-NP- β-D-xilopiranosida dan p-NP-α-L-arabinopiranosida
Sakka et al. 1993. Xilanase Clostridium cellulovorans diketahui memiliki aktivitas glikosil hidrolase famili 11 dan asetilxilan esterase Kosugi et al. 2002. Menurut Lee
et al . 2003, kecambah Hordeum vulgare L menghasilkan
β-D-xilosidase dan α-L- arabinofuranosidase dengan BM yang sama 67 kDa tetapi memiliki pI berbeda.
Masing-masing enzim tersebut dapat menghidrolisa substrat p-NP- β-D-xilosida dan
p -NP-
α-L-arabinofuranosida tetapi efesiensi katalitiknya berbeda. Aktivitas β-D-
xilosidase terhadap p-NP- β-D-xilosida 30 kali lipat aktivitasnya terhadap p-NP-α-L-
arabinofuranosida, sedangkan aktivitas α-L-arabinofuranosidase terhadap p-NP-α-L-
arabinofuranosida hanya sedikit lebih tinggi dibandingkan aktivitasnya terhadap p- NP-
β-D-xilosida. Xilanase Xyl2 dan Xyl3 Streptomyces sp. strain S38 juga mampu menghidrolisa substrat p-NP-xilosida dan p-NP-selobiosida sedangkan Xyl1 tidak
dapat Georis et al. 2000.
V SIMPULAN DAN SARAN
5.1 Simpulan
