3.7. Pelaksanaan Penelitian
3.7.1. Pemeliharaan Hewan Coba
Induk bunting ditempatkan pada kandang yang terpisah hingga melahirkan. Kandang terbuat dari bahan plastik ukuran 30 x 20 x 10 cm yang ditutup kawat kasa
halus ataupun tutup plastik. Dasar kandang dilapisi dengan sekam padi setebal 0,5 – 1 cm dan diganti setiap hari. Makanan dan minuman diberikan secara berlebih-lebihan.
Pencahayaan diatur dengan siklus 12 jam terang, 12 jam gelap, sedangkan temperatur dan kelembaban ruangan dibiarkan berada pada kisaran alamiah. Setelah fetus lahir,
litter jantan berumur 9 hari dipisahkan dari induknya. Setiap induk hanya menyusui 3-4 litter betina hingga usia sapih. Setiap kandang dituliskan tanggal kelahiran untuk
menentukan usia mencit.
Gambar 2. Mencit Betina Bunting dan Litter F1 Betina Umur 10 Hari
Universitas Sumatera Utara
3.7.2. Pemberian Perlakuan
Perlakuan diberikan pada saat usia mencit 10 hari sebanyak 5 kali dengan interval waktu 2 hari hari 10, 12, 14, 16, 18. Berat badan mencit ditimbang terlebih
dahulu dengan timbangan hewan setiap sebelum diberi suntikan. 4mggbb MSG dilarutkan ke dalam 0,1 cc NaCl 0,9 dan disuntikkan kepada 16 ekor mencit secara
intraperitoneum dengan menggunakan spuit 1 cc. Sedangkan 16 mencit kontrol hanya disuntikkan NaCl 0,9 dengan volume yang sama. Dari satu induk yang, 2 ekor anak
mencit diberi perlakuan sedangkan 2 ekor lagi sebagai kontrol. Pada ekor setiap anak mencit diberi tanda dengan spidol untuk membedakan kontrol atau perlakuan. Anak
mencit dibiarkan tetap menyusui kepada induknya. Setelah usia sapih 21 hari, anak mencit dipisahkan dari induknya dan
ditempatkan pada kandang yang berbeda untuk memudahkan identifikasi. Kedua ekor mencit kontrol ditempatkan terpisah dengan kedua mencit perlakuan. Kandang jangan
lupa diberi tanda. Selama pemberian perlakuan dan setelah disapih hingga eksekusi, berat badan
mencit ditimbang setiap hari untuk memantau kenaikan berat badan. Sejak usia 22 hari, pada mencit dilakukan hapusan vagina vaginal smear
untuk mengamati siklus estru setiap hari antara pukul 08.00 – 12.00. Pengamatan dilakukan di bawah mikroskop histologi. Dan fase-fase dalam siklus estrus dicatat
dalam tabel yang telah disediakan Lampiran 6. Setelah Mencit mencapai fase estrus, mencit dieksekusi untuk diambil darah dan ovariumnya. Untuk kelompok I dan II
Universitas Sumatera Utara
dieksekusi setelah 4x pengamatan estrus, kelompok III dan IV 3x estrus, kelompok V
dan VI 2x estrus dan kelompok VII dan VIII 1x estrus ethical clearance terlampir.
3.7.2.1. Pembuatan sediaan apusan vagina Cotton bud dibasahi dengan alkohol 70. Apusan dilakukan dari pinggir
vulva hingga 3 mm ke dalam. Hasil apusan dioleskan ke atas objek glass secara
merata, kemudian di atas apusan ditetesi methilen blue. Dibiarkan beberapa saat, kemudian dicuci dengan air kran. Keringkan di atas kertas tissue. Setelah kering
sediaan diamati di bawah mikroskop histologi dengan pembesaran 40x. 3.7.2.2. Teknik pengambilan darah
Mencit dianastesi dengan ketamine, dosis 50-400 mgkgbb Kusumawati D. Disuntikkan secara intraperitoneum. Setelah mencit lemas, thorax dibuka, darah
diambil dari bagian apek jantung dengan menggunakan spuit 1 cc yang telah dibilas dengan heparin. Pada saat pengambilan darah, hindarkan seminimal mungkin
tindakan yang dapat menimbulkan terjadinya hemolisa. Segera setelah darah diambil, dilakukan pemeriksaan hormon estradiol.
3.7.2.3. Pemeriksaan hormon Estradiol Metode
: ELFA Enzym Linke Flourescent Assay Sampel
: serum 200 ul Alat
: MINIVIDAS, pipet 50 -200 ul Langkah kerja
: 1.
Sampel darah disentrifuge untuk dipisahkan plasma dengan sel-sel darah.
Universitas Sumatera Utara
2. Keluarkan regen dari kulkas biarkan selama 30 menit pada suhu kamar.
3. Sebelum regen digunakan, reagensia dikalibrasi terlebih dahulu.
4. Siapkan kontrol.
Setelah kalibrasi dan kontrol masuk pada range yang tertera pada MLE Card reagen, vidas bisa digunakan untuk running, caranya:
a. Pilih status screen dari main menu
pilih section A atau B, pilih posisi dimana strip akan ditempatkan.
b. Tekan tombol “Assay”
tekan tombol “select assay” pilih parameter Estradiol E2.
c. Pilih “Sampel ID” dan ketik no. ID pasien, tekan tombol “Previous Screen”.
d. Pipet 200 ul sampel masukkan ke dalam reagen strip TES, beri identitas.
e. Masukkan reagen strip ke dalam tray reagen strip dan SPR TES pada lubang
SPR, tutup cover. f.
Tekan “Start” untuk menjalankan, tunggu 60 menit sampai keluar hasil.
Nilai rujukan: Estradiol dapat terbaca bila nilai 9 pgml NB: Bila serum tidak mencukupi, maka dapat dilakukan pengenceran dengan NaCl
0,9, hasil dikalikan dengan berapa kali pengenceran. 3.7.2.4. Pengamatan ovarium
Setelah mencit dieksekusi, rongga abdomen dibuka, ovarium kanan dan kiri dipisahkan dari oviduct. Ovarium dibersihkan dari lemak sekitarnya, dimasukkan ke
Universitas Sumatera Utara
dalam botol plastik yang di dalamnya berisi cairan Bouin. Corpus luteum yang berupa benjolan-benjolan berwarna kuning di permukaan ovarium dihitung di bawah
mikroskop stereo. Dilanjutkan dengan pemeriksaan histologi ovarium untuk melihat perkembangan folikel, jumlah corpus luteum, folikel de graff dan folikel atretik.
3.7.2.5. Pembuatan preparat histologi ovarium Sediaan histologi ovarium dibuat mengikuti metode rutin Mukawi, 1989.
Jaringan difiksasi dengan larutan Bouin, ditanam dalam blok parafin. Sediaan disayat dengan mikrotom putar setebal 2 µm, direkatkan ke objek gelas yang telah diteteskan
albumin dan diwarnai dengan hematoksilin-Eosin. Sediaan histrologi ovarium yang diamati adalah sediaan yang berasal dari potongan ovarium bagian tengah.
3.8. Analisis Data dan Pengujian Hipotesis
Kategori