cooled colid spot Lampiran 4 gambar 5, Deparafinization and target retrival PT LINK DACO Lampiran 4 gambar 7.
3.8.2 Bahan Penelitian
Bahan penelitian yang digunakan pada penelitian ini adalah : 1. Parafin blok KSS rongga mulut.
2. Novostain Universal Detection Kit NCL-RTU-D Novocastra, Inggris. 3. Antibodi primer yang digunakan: antibody LMP-1 novo ready to use.
4. Larutan PBS Phosphate Buffered Saline pH 7,2. 5. Larutan Buffer Sitrat Sodium Citrate Buffer pH 6,0.
6. IHC diluent Lampiran 4 gambar 8a. 7. Larutan kromogen DAB Lampiran 4 gambar 8b.
8. Haematoxiline. 9. acid alkohol.
10. Eosin 1. 11. Alkohol 80, 95, absolut.
12. Xylol. 13. Saline.
14. Kanada balsam.
3.9. Metode Pengumpulan Data Pelaksanaan penelitian
Tahap-tahap pengambilan dan pengumpulan data pada penelitian ini adalah sebagai berikut :
3.9.1 Pembuatan sediaan mikroskopis dari blok parafin.
Blok parafin yang telah dikumpulkan, disimpan dalam freezer sampai cukup dingin, selanjutnya dipotong tipis dengan menggunakan mikrotom dengan tebal 4
32
Universitas Sumatera Utara
atau 5 . Setiap blok parafin, dipotong sebanyak 2 kali, masing-masing untuk
pulasan HE dan pulasan imunohistokimia Lmp-1. 1.
Tempel blok parafin pada kaca objek. 2.
Untuk pulasan imunohistokimia Lmp-1, digunakan kaca objek yang telah di coating agar jaringan dapat menempel pada kaca objek selama proses pulasan
imunohistokimia Lampiran 5a.
3.9.2 Prosedur Pewaraan Hematoxiline-eosin.
1. Setelah difiksasi, kaca objek dicelupkan dalam hematoxiline selama 5 menit lalu dibilas dengan air mengalir selama 3 menit.
32
2. Kaca objek tersebut dicelupkan kedalam acid alkohol 1 1-2 celup lalu dibilas kembali dengan air mengalir selama 3 menit.
3. Lakukan pewarnaan dengan eosin untuk mewarnai nukleus selama 2-3 menit lalu bilas kembali dengan air mengalir selama 3 menit.
4. Kemudian kaca objek dicelupkan kedalam alkohol 80 selama 30 menit, alkohol 95 selama 3 menit dan alkohol absolut selama 3 menit.
5. Kaca objek dicelupkan kedalam xylol selama 3 menit sebanyak 3 kali pengulangan.
6. Kaca objek di mounting dengan kanada balsem dan ditutup dengan deck glass.
3.9.3 Prosedur pulasan imunohistokimia dengan antibodi monoclonal
Lmp-1 Clones CS1-4, ready to use, Dako Co, Denmark.
1. Lakukan deparafinasi preparat dengan xylene sebanyak 3 kali masing- masing 3 menit.
32
2. Rehidrasi preparat dengan menggunakan etanol 100, etanol 95 dan etanol 70 masing- masing selama dua menit, dua menit, satu menit dan terakhir
dengan air selama satu menit. 3. Rendam dalam peroxidase blocking solution pada suhu kamar selama 10
menit. 4. Inkubasi preparat dalam prediluted blocking serum 25°C selama 10 menit.
Universitas Sumatera Utara
5. Rendam preparat di dalam antibodi monoclonal Lmp-1 25°C selama 10 menit.
6. Cuci preparat dengan Phospate Buffer Saline PBS selama 5 menit. 7. Inkubasi preparat dengan antibodi sekunder conjugated to horse radish
peroxidase 25°C selama 10 menit. 8. Cuci preparat dengan PBS selama 5 menit.
9. Inkubasi preparat dengan peroksidase 25°C selama 10 menit. 10. Cuci preparat dengan PBS selama 5 menit.
11.Inkubasi preparat dengan kromogen DAB Diaminobenzinidine 25°C selama 10 menit.
12. Inkubasi preparat dengan Hematoxylin Eosin selama 3 menit. 13. Cuci preparat dengan air mengalir.
14. Bersihkan preparat dan tetesi dengan mounting media. 15. Tutup preparat dengan coverslip.
16. Amati tampilan Lmp-1 warna coklat pada sel menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 400 x Gambar 3.1.
17.Dokumentasi setiap pengamatan dan lakukan pemotretan tiap preparat Lampiran 5b.
3.10. Pengolahan dan Analisa Data
