karbon, akuades, NaCl fisiologis 0,85, kloroform:metanol, HCl, dan hidrokarbon uji bensin.
3.3. Cara Kerja
3.3.1. Penguapan Gliserol
Gliserol sebelum disterilisasi diuapkan terlebih dahulu diatas hot plate dengan suhu 80 – 100
C selama ±1 jam, hal ini dilakukan dengan tujuan untuk memurnikan gliserol dengan memisahkan metanol.
3.3.2. Pembuatan Medium Bushnell-Haas
Sebanyak 0,2 gram MgSO
4.
7H
2
O; 1 gram K
2
HPO
4;
1 gram KH
2
PO
4;
0,05 gram FeCl
3;
1 gram NH
4
NO
3;
0,02 gram CaCl
2.
2H
2
O; dan 1,2 gram yeast ekstrak dimasukkan ke dalam erlenmeyer ukuran 1L, ditambahkan crude gliserol limbah
biodiesel sebagai sumber karbon sebanyak 2, 4, da 6 vv, seluruh komponen dilarutkan dengan akuades hingga mencapai 1L dan diaduk hingga
larut. pH medium diatur pada pH 7 selanjutnya disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121
C selama 15 menit. Untuk pembuatan Bushnell-Haas Agar, dimasukkan semua komponen diatas tanpa crude gliserol dan ditambahkan 15
gram agar Atlas, 2004.
3.3.3. Peremajaan Kultur Stok Satu ose isolat dari kultur stok diinokulasikan ke dalam agar miring
Bushnell-Haas dengan cara gores. Kemudian diinkubasi selama 24 – 48 jam pada
suhu 28 C.
3.3.4. Pembuatan Kurva Standar
Kultur stok ditambahkan sebanyak 10 ml medium cair Bushnell-Haas, lalu dikocok menggunakan vortex dengan kecepatan maksimum. Dilakukan
pengenceran dengan akuades menggunakan rasio perbandingan konsentrasi pengenceran 0,5, 1, 1,5, 2, dan 2,5, dan dari tiap pengenceran dilakukan
pengukuran kekeruhan dengan menggunakan spektrofotometri pada panjang gelombang 600nm dan jumlah sel dengan total plate count TPC. Data dari TPC
dan kekeruhan diplotkan dalam bentuk kurva sebagai kurva standar. Data yang diperoleh dijadikan sebagai acuan untuk pengukuran jumlah sel pada tahap
selanjutnya. Total plate count
TPC dilakukan dengan menggunakan medium Bushnell-Haas Agar
dan pengenceran berseri. Pengenceran berseri dilakukan dengan cara sebagai berikut: 1 ml kultur dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan
ditambahkan 9 ml larutan NaCl fisiologis 0,85 steril ke dalamnya, lalu kocok dengan vortex; suspensi yang terbentuk disebut pengenceran 1:10 atau 10
-1
. Kemudian diambil 1 ml suspensi dari pengenceran 10
-1
dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 9 ml larutan NaCl fisiologis 0,85 steril, lalu kocok dengan
vortex; suspensi yang terbentuk disebut pengenceran 1:10 atau 10
-2
. Selanjutnya
lakukan cara yang serupa untuk pengenceran 10
-3
10
-4
10
-5
sampai dengan pengenceran 10
-10
jumlah pengenceran dalam satu seri tergantung pada kekeruhan kultur.
Dari tiga pengenceran terakhir 10
-8
10
-9
dan 10
-10
masing-masing diambil 0,1 ml dengan menggunakan pipet steril yang berbeda, kemudian dilakukan
inokulasi pada tiga plat agar berbeda yang telah berisi medium Bushnell-Haas Agar
. Suspensi disebarkan pada permukaan plate agar dengan menggunakan batang glass drygalski hingga merata secara aseptis. Selanjutnya Plat agar
diinkubasi pada suhu 28 C selama 24 - 48 jam. Kemudian dilakukan
penghitungan jumlah koloni yang tumbuh pada setiap plate agar. Jumlah yang dapat dihitung adalah 30-300 koloni. Jumlah sel dinyatakan dengan rumus:
3.3.5. Pembuatan Prekultur
