BAB III METODOLOGI PENELITIAN
3.1. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini telah dilakukan pada bulan Juni – November 2009 di Laboratorium Mikrobiologi Balai Teknologi Lingkungan – BPPT, Serpong.
3.2. Alat dan Bahan
Alat – alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah laminar air flow cabinet
Panasonic, rotary shaker Multi Shaker PSU 20 Boeco, inkubator Memmert, sentrifuge Sorvall
®
RMC 14, spektrofotometer UV-Vis V-530 Jasco, pH meter WTW 82362 Weilheim, Vortex Yellow Line, timbangan
analitik Sartorius – CP224 S, autoklaf All American Model No. 25 X, hot plate Cimarec
®
2, rotary evaporator Heidolph, labu distilasi Iwaki Pyrex, corong pisah Iwaki Pyrex, oven Memmert, Microwave Panasonic, Mikropipet,
erlenmeyer Iwaki Pyrex 500 ml dan 250 ml, cawan petri Iwaki Pyrex, tabung reaksi Iwaki Pyrex, botol Schott Duran, glass beker Iwaki Pyrex, mikrotip,
mikrotube, ose lup, bunsen, penggaris cm, dan kamera digital. Bahan – bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat bakteri
Lysinibacillus spaerichus , medium Bushnell-Haas per liter akuades Atlas,
1994: 0,2 gram MgSO
4.
7H
2
O; 1 gram K
2
HPO
4;
1 gram KH
2
PO
4;
0,05 gram FeCl
3;
1 gram NH
4
NO
3;
0,02 gram CaCl
2.
2H
2
O; dan ditambahkan 1,2 gram yeast ekstrak. Bushnell-Haas Agar, crude gliserol limbah biodiesel sebagai sumber
karbon, akuades, NaCl fisiologis 0,85, kloroform:metanol, HCl, dan hidrokarbon uji bensin.
3.3. Cara Kerja
3.3.1. Penguapan Gliserol
Gliserol sebelum disterilisasi diuapkan terlebih dahulu diatas hot plate dengan suhu 80 – 100
C selama ±1 jam, hal ini dilakukan dengan tujuan untuk memurnikan gliserol dengan memisahkan metanol.
3.3.2. Pembuatan Medium Bushnell-Haas
Sebanyak 0,2 gram MgSO
4.
7H
2
O; 1 gram K
2
HPO
4;
1 gram KH
2
PO
4;
0,05 gram FeCl
3;
1 gram NH
4
NO
3;
0,02 gram CaCl
2.
2H
2
O; dan 1,2 gram yeast ekstrak dimasukkan ke dalam erlenmeyer ukuran 1L, ditambahkan crude gliserol limbah
biodiesel sebagai sumber karbon sebanyak 2, 4, da 6 vv, seluruh komponen dilarutkan dengan akuades hingga mencapai 1L dan diaduk hingga
larut. pH medium diatur pada pH 7 selanjutnya disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121
C selama 15 menit. Untuk pembuatan Bushnell-Haas Agar, dimasukkan semua komponen diatas tanpa crude gliserol dan ditambahkan 15
gram agar Atlas, 2004.
3.3.3. Peremajaan Kultur Stok Satu ose isolat dari kultur stok diinokulasikan ke dalam agar miring
Bushnell-Haas dengan cara gores. Kemudian diinkubasi selama 24 – 48 jam pada
suhu 28 C.
3.3.4. Pembuatan Kurva Standar
Kultur stok ditambahkan sebanyak 10 ml medium cair Bushnell-Haas, lalu dikocok menggunakan vortex dengan kecepatan maksimum. Dilakukan
pengenceran dengan akuades menggunakan rasio perbandingan konsentrasi pengenceran 0,5, 1, 1,5, 2, dan 2,5, dan dari tiap pengenceran dilakukan
pengukuran kekeruhan dengan menggunakan spektrofotometri pada panjang gelombang 600nm dan jumlah sel dengan total plate count TPC. Data dari TPC
dan kekeruhan diplotkan dalam bentuk kurva sebagai kurva standar. Data yang diperoleh dijadikan sebagai acuan untuk pengukuran jumlah sel pada tahap
selanjutnya. Total plate count
TPC dilakukan dengan menggunakan medium Bushnell-Haas Agar
dan pengenceran berseri. Pengenceran berseri dilakukan dengan cara sebagai berikut: 1 ml kultur dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan
ditambahkan 9 ml larutan NaCl fisiologis 0,85 steril ke dalamnya, lalu kocok dengan vortex; suspensi yang terbentuk disebut pengenceran 1:10 atau 10
-1
. Kemudian diambil 1 ml suspensi dari pengenceran 10
-1
dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 9 ml larutan NaCl fisiologis 0,85 steril, lalu kocok dengan
vortex; suspensi yang terbentuk disebut pengenceran 1:10 atau 10
-2
. Selanjutnya
lakukan cara yang serupa untuk pengenceran 10
-3
10
-4
10
-5
sampai dengan pengenceran 10
-10
jumlah pengenceran dalam satu seri tergantung pada kekeruhan kultur.
Dari tiga pengenceran terakhir 10
-8
10
-9
dan 10
-10
masing-masing diambil 0,1 ml dengan menggunakan pipet steril yang berbeda, kemudian dilakukan
inokulasi pada tiga plat agar berbeda yang telah berisi medium Bushnell-Haas Agar
. Suspensi disebarkan pada permukaan plate agar dengan menggunakan batang glass drygalski hingga merata secara aseptis. Selanjutnya Plat agar
diinkubasi pada suhu 28 C selama 24 - 48 jam. Kemudian dilakukan
penghitungan jumlah koloni yang tumbuh pada setiap plate agar. Jumlah yang dapat dihitung adalah 30-300 koloni. Jumlah sel dinyatakan dengan rumus:
3.3.5. Pembuatan Prekultur
Sebanyak tiga ose isolat dari slant agar diinokulasi ke dalam erlenmeyer ukuran 250 ml yang berisi 80 ml medium Bushnell-Haas+crude gliserol 2
sebagai sumber karbon, kemudian diinkubasi dalam rotary shaker dengan kecepatan agitasi 120 rpm pada suhu ruang selama 24 jam. Selanjutnya dilakukan
pengukuran kekeruhan dari kultur dengan menggunakan spektrofotometri pada koloni x n
+ koloni x n + koloni x n
10
-1
10
-1
10
-1
3 Ket:
n : faktor pengenceran
panjang gelombang 600nm. Inokulum prekultur digunakan sebagai inokulum untuk pembuatan kultur kurva pertumbuhan dan optimasi produksi biosurfaktan.
3.3.6. Pembuatan Kurva Pertumbuhan dan Optimasi Produksi Biosufaktan Inokulum dibuat dalam erlenmeyer 250 ml berisi 80 ml medium Bushnell-
Haas +crude gliserol 2, 4, dan 6 vv yang ditambahkan 5 vv inokulum
yang berasal dari prekultur, kemudian diinkubasi pada rotary shaker dengan agitasi 120 rpm pada suhu ruang. Pada jam ke-0 dan tiap 24 jam berikutnya
dilakukan pengukuran kekeruhan dengan menggunakan spektrofotometri pada panjang gelombang 600nm dan indeks emulsi IE
24
sebagai uji aktifitas emulsifikasi biosurfaktan.
3.3.7. Uji Aktifitas Emulsifikasi
Uji aktifitas emulsifikasi dilakukan menggunakan metode Cooper dan Goldenberg 1987. Sebanyak 5 ml kultur 3.3.6 disentrifugasi dengan agitasi
5000 rpm selama 30 menit pada suhu 4 C dengan tujuan untuk melisiskan sel.
Supernatan yang didapat selanjutnya diambil sebanyak 2 ml ditambahkan dengan 3 ml hidrokarbon uji bensin dan divortex dengan kecepatan maksimum selama 2
menit. Campuran tersebut kemudian didiamkan selama 24 jam yang selanjutnya diukur dengan perhitungan sebagai berikut :
tinggi lapisan emulsi E
24
= x 100 total tinggi
3.3.8. Ekstraksi Biosurfaktan
Ekstraksi biosurfaktan dilakukan terhadap kultur dengan nilai IE
24
terbaik. Dalam penelitian ini dilakukan ekstraksi dengan menggunakan pelarut kloroform:methanol. Hal ini dilakukan berdasarkan penelitian yang dilakukan
sebelumnya Maneerat Phetrong, 2007. Tiga puluh ml kultur 3.3.6 disentrifugasi 5000 rpm selama 30 menit
pada suhu 4 C dengan tujuan untuk melisiskan sel. Supernatan yang didapat
kemudian diasamkan dengan HCl sampai pH 2. Selanjutnya didiamkan satu malam pada suhu 4
C. Setelah itu, supernatan diekstraksi dengan kloroform:methanol 2:1 selama 10 menit dan dipekatkan dengan menggunakan
rotary evaporator . Pelet yang diperoleh dari hasil ekstraksi berwarna kekuning –
kuningan kemudian dikeringkan pada suhu 60 C, selanjutnya ditimbang sampai
diperoleh berat konstan. Berat ekstrak tersebut merupakan crude biosurfaktan.
3.4. Analisis Data
Untuk memilih konsentrasi gliserol yang memberikan pertumbuhan optimum bagi L. sphaericus digunakan analisis sidik ragam dengan rancang acak
lengkap pada taraf uji 0,05. Variabel yang dianalisis adalah jumlah sel dan Indeks Emulsi IE
24
sebagai parameter yang diuji. Pengambilan keputusan dilakukan berdasarkan nilai F-hitung dan F-tabel, yaitu jika jika F-hitung F-
tabel maka Ho diterima, dan jika nilai F-hitung F-tabel maka Ho ditolak. Jika hasil berbeda nyata atau sangat nyata pada taraf signifikansi 95, maka dilakukan
analisis lanjut dengan menggunakan uji Duncan. Untuk menganalisis hubungan
antara jumlah sel dengan Indeks Emulsi IE
24
digunakan uji Korelasi Pearson dengan menggunakan SPSS 12. Penentuan keeratan hubungan yang ditunjukkan
oleh nilai koefisien korelasi mengikuti kriteria berikut ini Nugroho, 2005: 1. 0,00 – 0,2 : Hubungan sangat lemah
2. 0,21 – 0,4 : Hubungan lemah 3. 0,41 – 0,7 : Hubungan kuat
4. 0,7 – 0,9 : hubungan sangat kuat 5. 0,91 – 0,99 : Hubungan sangat kuat sekali
6. 1 berarti korelasi sempurna
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Pertumbuhan Bakteri L. sphaericus
Pola pertumbuhan bakteri L. sphaericus pada medium perlakuan crude gliserol 2, 4, 6, dan kontrol menunjukkan pola yang hampir sama Gambar
1, yaitu tidak menunjukkan adanya fase adaptasi atau pertumbuhan langsung memasuki fase eksponensial. Hal ini terjadi karena bakteri L. sphaericus
ditumbuhkan dalam medium utama pertumbuhan yang sama dengan medium perlakuan, yaitu pada medium Bushnell-Haas+yeast ekstrak dengan penambahan
crude gliserol 2, sehingga sel sudah siap tumbuh dalam medium yang baru
tanpa melalui fase adaptasi. Seperti yang dijelaskan oleh Purwoko 2007 bahwa sel tidak memerlukan fase adaptasi ketika ditumbuhkan dalam medium dan
lingkungan pertumbuhan yang sama dengan medium dan lingkungan sebelumnya.
Kategori