lakukan cara yang serupa untuk pengenceran 10
-3
10
-4
10
-5
sampai dengan pengenceran 10
-10
jumlah pengenceran dalam satu seri tergantung pada kekeruhan kultur.
Dari tiga pengenceran terakhir 10
-8
10
-9
dan 10
-10
masing-masing diambil 0,1 ml dengan menggunakan pipet steril yang berbeda, kemudian dilakukan
inokulasi pada tiga plat agar berbeda yang telah berisi medium Bushnell-Haas Agar
. Suspensi disebarkan pada permukaan plate agar dengan menggunakan batang glass drygalski hingga merata secara aseptis. Selanjutnya Plat agar
diinkubasi pada suhu 28 C selama 24 - 48 jam. Kemudian dilakukan
penghitungan jumlah koloni yang tumbuh pada setiap plate agar. Jumlah yang dapat dihitung adalah 30-300 koloni. Jumlah sel dinyatakan dengan rumus:
3.3.5. Pembuatan Prekultur
Sebanyak tiga ose isolat dari slant agar diinokulasi ke dalam erlenmeyer ukuran 250 ml yang berisi 80 ml medium Bushnell-Haas+crude gliserol 2
sebagai sumber karbon, kemudian diinkubasi dalam rotary shaker dengan kecepatan agitasi 120 rpm pada suhu ruang selama 24 jam. Selanjutnya dilakukan
pengukuran kekeruhan dari kultur dengan menggunakan spektrofotometri pada koloni x n
+ koloni x n + koloni x n
10
-1
10
-1
10
-1
3 Ket:
n : faktor pengenceran
panjang gelombang 600nm. Inokulum prekultur digunakan sebagai inokulum untuk pembuatan kultur kurva pertumbuhan dan optimasi produksi biosurfaktan.
3.3.6. Pembuatan Kurva Pertumbuhan dan Optimasi Produksi Biosufaktan Inokulum dibuat dalam erlenmeyer 250 ml berisi 80 ml medium Bushnell-
Haas +crude gliserol 2, 4, dan 6 vv yang ditambahkan 5 vv inokulum
yang berasal dari prekultur, kemudian diinkubasi pada rotary shaker dengan agitasi 120 rpm pada suhu ruang. Pada jam ke-0 dan tiap 24 jam berikutnya
dilakukan pengukuran kekeruhan dengan menggunakan spektrofotometri pada panjang gelombang 600nm dan indeks emulsi IE
24
sebagai uji aktifitas emulsifikasi biosurfaktan.
3.3.7. Uji Aktifitas Emulsifikasi
Uji aktifitas emulsifikasi dilakukan menggunakan metode Cooper dan Goldenberg 1987. Sebanyak 5 ml kultur 3.3.6 disentrifugasi dengan agitasi
5000 rpm selama 30 menit pada suhu 4 C dengan tujuan untuk melisiskan sel.
Supernatan yang didapat selanjutnya diambil sebanyak 2 ml ditambahkan dengan 3 ml hidrokarbon uji bensin dan divortex dengan kecepatan maksimum selama 2
menit. Campuran tersebut kemudian didiamkan selama 24 jam yang selanjutnya diukur dengan perhitungan sebagai berikut :
tinggi lapisan emulsi E
24
= x 100 total tinggi
3.3.8. Ekstraksi Biosurfaktan
Ekstraksi biosurfaktan dilakukan terhadap kultur dengan nilai IE
24
terbaik. Dalam penelitian ini dilakukan ekstraksi dengan menggunakan pelarut kloroform:methanol. Hal ini dilakukan berdasarkan penelitian yang dilakukan
sebelumnya Maneerat Phetrong, 2007. Tiga puluh ml kultur 3.3.6 disentrifugasi 5000 rpm selama 30 menit
pada suhu 4 C dengan tujuan untuk melisiskan sel. Supernatan yang didapat
kemudian diasamkan dengan HCl sampai pH 2. Selanjutnya didiamkan satu malam pada suhu 4
C. Setelah itu, supernatan diekstraksi dengan kloroform:methanol 2:1 selama 10 menit dan dipekatkan dengan menggunakan
rotary evaporator . Pelet yang diperoleh dari hasil ekstraksi berwarna kekuning –
kuningan kemudian dikeringkan pada suhu 60 C, selanjutnya ditimbang sampai
diperoleh berat konstan. Berat ekstrak tersebut merupakan crude biosurfaktan.
3.4. Analisis Data
