menjadi penting karena pada proses PCR, DNA yang masih utuh akan lebih memberikan hasil yang relatif lebih akurat.
Hasil pengukuran kuantitas dan kemurnian dari 31 DNA genom markisa dengan nanofotometer IMPLEN P-360 NanoPhotometer P-Class menunjukkan
kemurnian DNA yang baik dan kuantitasnya yang cukup Lampiran 2. Kemurnian yang diperoleh berkisar antara 1,368-2,112. Menurut Sambrook
Russel 1989, batas kemurnian yang biasa digunakan dalam analisis molekuler pada rasio A
260
A
280
adalah 1,8-2,0. Kemurnian yang diperoleh tidak semuanya memenuhi batas kriteria untuk dapat digunakan dalam analisis molekuler 1,8,
namun pada penelitian yang telah dilakukan oleh Minarsih et al., 2011, terhadap keragaman genetik Ganoderma spp., nilai kemurnian 1,069 merupakan nilai
terendah tetapi sudah dapat digunakan untuk proses PCR-RAPD. Selain itu pada penelitian yang telah dilakukan oleh Bayzura 2014 Aulia 2014 terhadap
tanaman kelapa sawit, nilai kemurnian 1,5 - 1,7 sudah dapat digunakan untuk melakukan proses PCR-RAPD. Rendahnya nilai rasio A
260
A
280
1,8, dapat disebabkan oleh kontaminasi protein dan bahan organik lainnya sebaliknya
kontaminasi fenol ditandai dengan tingginya nilai rasio tersebut 2,0 Linacero et al., 1998.
Konsentrasi DNA genom markisa yang diperoleh berkisar antara 42,5 sampai 2552 ngµl. Konsentarsi DNA yang biasanya digunakan dalam proses
PCR adalah 0,5-50 ngµl, maka konsentrasi yang didapatkan pada penelitian ini sudah cukup memenuhi syarat dalam melakukan RAPD. Menurut Haris et al.
2003, konsentrasi DNA akan berdampak pada kualitas fragmen hasil amplifikasi. Konsentrasi DNA yang rendah akan menghasilkan fragmen yang
tipis, sebaliknya konsentrasi DNA yang tinggi akan menyebabkan fragmen terlihat tebal sehingga sulit membedakan antar fragmen.
4.2. Analisis Profil Pita RAPD Tanaman Markisa
Amplifikasi dengan menggunakan primer RAPD yang dilakukan terhadap DNA genom markisa menghasilkan produk PCR yang dapat dibaca dan diskor,
sehingga hasilnya dapat dianalisis. Dari 7 primer yang digunakan, hanya 4 primer
dapat mengamplifikasi DNA genom dan menghasilkan pita DNA polimorfik, sedangkan primer lainnya tidak menghasilkan pita.
Primer yang dapat mengamplifikasi DNA genom pada 31 aksesi yaitu primer Akansha 7, OPA 04, OPB 08, dan OPB 18 sedangkan primer OPB 19,
OPB 20 dan AB 11 tidak dapat mengamplifikasi pita DNA genom. Menurut Kumar et al. 2011, ketidakcocokan antara primer dengan template DNA dapat
mengakibatkan ketiadaan total produk PCR. Keempat primer yang menghasilkan pita DNA polimorfik selanjutnya digunakan untuk mengamplifikasi DNA genom
dari 31 aksesi markisa Lampiran 3.. Primer yang digunakan dalam analisis RAPD adalah sintetis
oligonukleotida pendek 10 pasang basa dengan sekuens acak untuk
mengamplifikasi kuantitas
nanogram dari
total genomik
DNA Kumar et al., 2011. Menurut Hannum 2001, RAPD merupakan hasil
berpasangnya nukleotida primer dengan nukleotida genom tanaman, semakin banyak primer yang digunakan akan semakin terwakili bagian-bagian genom,
sehingga semakin tergambar keadaan genom tanaman yang sesungguhnya. Perbedaan jumlah dan polimorfisme pita DNA yang dihasilkan dari setiap primer
menggambarkan kekompleksan
genom tanaman
yang diamati
Grattapaglia et al, 1992. Profil pita DNA pada primer Akansha 7 terhadap 31 aksesi markisa
Gambar 4.2. menunjukkan pola pita yang berbeda antar aksesi dengan total pola pita yang dihasilkan sebanyak 25 pola dengan ukuran
475 – 2279
bp. Hasil amplifikasi menyatakan bahwa dengan penggunaan primer Akansha
7 pada 31 aksesi markisa menghasilkan profil pita yang baik dengan keadaan pita jelas. Hal ini dipengaruhi oleh kondisi DNA hasil ekstraksi yang menunjukkan
adanya kesamaan sekuens antara DNA cetakan dengan primer. Menurut Langga 2012, semakin banyak sekuens yang dapat dikenali oleh primer pada sebuah
DNA template akan menghasilkan pita yang lebih banyak.
M 1 2
3 4 5 6 7 8 9 10
M 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
M 25
26 27
28 29
30 31
Gambar 4.2. Profil Pita RAPD tanaman markisa dengan primer Akansha. M= Marker 1kb, nomor 1-31 = aksesi markisa Lampiran 1.
Jumlah dan intensitas pita DNA yang dihasilkan setelah amplifikasi DNA dengan PCR sangat tergantung bagaimana primer mengenal urutan DNA
komplementernya pada cetakan DNA. Hasil amplifikasi DNA tidak selalu memperoleh pita dan intensitas yang sama. Intensitas pita DNA produk PCR pada
setiap primer sangat dipengaruhi oleh kemurnian dan konsentrasi cetakan DNA. Cetakan DNA yang mengandung senyawa-senyawa seperti polisakarida dan
senyawa fenolik, serta konsentrasi DNA yang terlalu kecil sering menghasilkan pita DNA amplifikasi yang redup atau tidak jelas Weeden et al., 1992 dalam
Harahap, 2014. Menurut Hannum 2001, jumlah pita DNA yang dihasilkan oleh setiap primer bergantung pada sebaran situs yang homolog dengan sekuen primer
pada genom. Keempat primer yang digunakan memperlihatkan bahwa jumlah pita yang
dihasilkan pada setiap primer berbeda. Dari keempat primer tersebut
menghasilkan jumlah pita sebanyak 13-25 pola pita DNA per primer. Ukuran pita
A
C B
2000 bp 1500 bp
1000 bp 750 bp
500 bp 250 bp
2000 bp 1500 bp
1000 bp 750 bp
500 bp 250 bp
250 bp 500 bp
750 bp 1000 bp
1500 bp 2000 bp
yang dihasilkan bervariasi yaitu 229-2279 bp. Persentase pita polimorfik sebesar 100 akansha 7, OPA 04, OPB 08 dan 94 pada primer OPB 18.
Tabel 4.1. Persentase Pita Polimorfik pada 4 primer
No. Nama
Primer Ukuran Pita
bp Total
Pita Jumlah Pita
Polimorfik Jumlah Pita
Monomorfik Persentase
Pita Polimorfik
1. Akansha 7
475 - 2279 25
25 100
2. OPA 04
285 - 1573 19
19 100
3. OPB 08
252 - 1306 13
13 100
4. OPB 18
229 - 1409 17
16 1
94 Total
74 73
1 98
Jumlah dan ukuran pita tertinggi terdapat pada primer Akansha 7 yang berjumlah 25 pita pada ukuran sekitar lebih dari 2279 bp, sedangkan jumlah dan ukuran pita
terendah terdapat pada primer OPB 18 dengan jumlah 13 pita pada ukuran 229 bp Primer Akansha 7 menghasilkan 25 pita DNA dengan persentase
polimorfik sebesar 100, pada penelitian Lade et al. 2014, dari 10 primer Akansha yang dioptimasi untuk mengamplifikasi DNA markisa liar P. foetida,
primer Akansha 7 merupakan primer dengan angka amplifikasi tertinggi yaitu 9 pita fragmen.
Primer OPA 04, OPB 08, dan OPB 18 menghasilkan pita berturut-turut adalah 19, 13 dan 17 pita. Dari ketiga primer tersebut dapat dibandingkan bahwa
primer OPA 04 merupakan primer yang dapat menghasilkan pita terbanyak. Hal ini juga ditunjukkan dalam penelitian yang telah dilakukan oleh Crochemore et al.
2003, tentang keanekaragaman genetik passion fruit Passiflora spp. dengan penggunaan primer yang sama yaitu primer OPA 04 memperlihatkan angka
amplifikasi tertinggi sebanyak 33 pita, primer OPB 18 mengamplifikasi sebanyak 29 pita, sedangkan primer OPB 08 menghasilkan pita terendah yaitu 26 pita.
4.3. Analisis Keanekaragaman Genetik Tanaman Markisa 4.3.1. Analisis Hubungan Genetik Markisa Ungu
