kesesuaiannya dengan fasilitas dan materi yang dimiliki untuk melakukan seleksi. Penyiapan atau purifikasi gen target juga sangat menentukan keberhasilan dari
seleksi yang dilakukan Syafaruddin Santoso, 2011. Jenis marka molekular pada tanaman ada dua yaitu penanda mendasarkan
teknik PCR dan yang tidak mendasarkan teknik PCR. Penanda molekular yang mendasarkan teknik PCR antara lain RAPD Random Amplified Polymorphic
DNA, AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism dan SSR Simple Sequence Repeats yang lebih mendasarkan pada sequencing DNA. Sedangkan
penanda molekuler yang tidak mendasarkan teknik PCR hanya ada satu jenis yaitu RLFP Restriction Fragment Length Polymorphism Azrai, 2005. Setiap
penanda molekuler memiliki teknik yang berbeda-beda baik dalam hal jumlah DNA yang dibutuhkan, dana, waktu, prosedur pelaksanaan, tingkatan
polimorfisme dan pengujian secara statistik. Penanda tersebut masing-masing mempunyai kelebihan dan kelemahan, oleh karena itu kombinasi beberapa teknik
akan memberikan data yang lebih komprehensif dan akurat. Penentuan teknik yang digunakan sangat penting untuk mendapatkan hasil sesuai dengan yang
diinginkan. Umumnya strategi pemilihan teknik berdasarkan pada tujuan studi, ketersediaan dana dan fasilitas serta kemampuan sumber daya manusia
Afifah, 2012.
2.4. Penanda Molekuler RAPD
Teknik RAPD Random Amplified Polymorphic DNA merupakan salah satu metode yang dapat digunakan dalam analisis DNA tanaman dengan menggunakan
alat Polymerase Chain Reaction PCR. Alat ini berguna mengamplifikasi DNA hasil ekstraksi dalam jumlah kecil dan waktu singkat. Penanda molekular RAPD
dihasilkan melalui proses amplifikasi DNA secara in vitro dengan PCR William et al., 1990.
Dasar polimorfisme DNA berdasarkan Polymerase Chain Reaction PCR menggunakan primer tunggal dari urutan nukleotida acak dan terdeteksi sebagai
produk amplifikasi segmen DNA acak. Polimorfisme, disebut juga dengan random amplified polymorphic DNA RAPD marker yang membedakan antara
dua individu berdasarkan perbedaan kromosomal atau perbedaan basa
berdasarkan untaian primer Javornik Kump, 1993. Menurut Syafaruddin Santoso 2011, RAPD adalah penanda berbasis PCR dengan menggunakan 10
basa primer acak. Teknik RAPD tidak memerlukan informasi awal tentang urutan basa suatu spesies. Yang diperlukan adalah DNA yang relatif murni dan dalam
jumlah yang relatif kecil dibandingkan dengan RFLP. Oleh karenanya RAPD dapat diterapkan pada hampir semua jenis tanaman. DNA sebagai pembawa
informasi genetik terdapat dalam sel khususnya di dalam inti sel dan untuk mendapatkannya dapat dilakukan dengan proses ekstraksi, sehingga, memudahkan
untuk mengidentifikasi DNA yang disebut isolasi DNA Langga et al., 2012. Metode RAPD merupakan pengembangan teknik PCR untuk mendeteksi
keanekaragaman genetik atau mengidentifikasi potongan DNA spesifik yang berkomplementer dengan DNA cetakan. RAPD bertujuan untuk menghasilkan
banyak copy dari DNA eetakan. Potongan-potongan acak yang umumnya berukuran antara 250-2000 pasangan basa bp diamplifikasi menggunakan PCR
dengan primer tunggal, yang pada umumnya berukuran 10 pasang basa. Reaksi RAPD umumnya menghasilkan 3-10 potongan DNA. Produk amplifikasi
biasanya dianalisis dengan elektroforesis pada gel agarosa yang dilanjutkan pengecatan dengan ethidium bromide Yasminingsih, 2009.
PCR adalah suatu metode untuk melipat gandakan suatu pita DNA secara in vitro. Metode PCR dikembangkan oleh Kary Mullis pada tahun 1986
Irawan, 2008. Proses terjadinya reaksi amplifikasi melalui tiga tahapan yaitu, a denaturasi, merupakan proses awal yang dilakukan dengan pemanasan hingga
96°C selama 30-60 detik. Pada suhu ini DNA utas ganda akan memisah menjadi utas tunggal, b annealing, setelah DNA menjadi utas tunggal, suhu diturunkan
ke kisaran 40-60°C selama 20-40 detik untuk memberikan kesempatan bagi primer untuk menempel pada DNA template di tempat yang komplemen dengan
sekuen primer, c ekstensionelongasi, merupakan proses akhir dimana dilakukan dengan menaikkan suhu ke kisaran suhu kerja optimum enzim DNA polymerase,
biasanya 70-72°C. Pada tahap ini DNA polymerase akan memasangkan dNTP yang sesuai pada pasangannya. Jika basa pada template adalah A, maka akan
dipasang dNTP T, begitu seterusnya pasangan A adalah T, dan C dengan G. Enzim akan memperpanjang rantai basa ini hingga ke ujung. Lamanya waktu
ekstensi bergantung pada panjangnya daerah yang akan diamplifikasi, secara umumnya adalah 1 menit untuk setiap 1000 bp Erlich, 1989. Tiga langkah
tersebut merupakan satu siklus PCR. Proses ini disebut chain reaction atau reaksi berantai sebab hasil dari langkah ke tiga, yaitu dua pita ganda, masing-masing
akan menjalani siklus PCR, mengalami denaturasi, annealing, dan pemanjangan lagi dan demikian seterusnya. Karena setiap hasil daur selalu melakukan reaksi
ulang yang sama inilah maka disebut reaksi berantai Irawan, 2008. Prosedur penggunaan RAPD ini mempunyai keutungan seperti sederhana,
mudah dalam hal preparasi, dapat dilakukan secara maksimal untuk sampel dalam jumlah banyak, jumlah DNA yang diperlukan relatif sedikit, dan pengerjaannya
tidak menggunakan senyawa radioaktif Syafaruddin Santoro, 2011. Menurut Anggraeni 2008, penanda RAPD memiliki beberapa kelebihan, diantaranya
tidak membutuhkan latar belakang pengetahuan genom yang akan dianalisis, primer universal dapat digunakan untuk organisme prokariotik maupun eukariotik,
mampu menghasilkan karakter yang relatif lebih murah, mudah dalam preparasi, dan memberikan hasil lebih cepat dibandingkan dengan analisis keragaman
molekulernya. Kelebihan lain yang lebih spesifik adalah teknik RAPD lebih sederhana, yaitu: 1 DNA tidak perlu dipotong dengan enzim restrikasi, 2
sampel DNA yang diperlukan relatif sedikit, 3 tidak perlu memindahkan DNA ke membran nilon, 4 tidak memerlukan hibridisasi DNA dan 5 tidak
memerlukan prosedur labeling. Penanda RAPD telah berhasil digunakan untuk tujuan dalam bidang
pemuliaan tanaman antara lain: 1 penyusunan peta genetik, 2 analisis struktur genetik populasi, 3 sidik jari individu, 4 pemetaan sifat-sifat, dan 5 penanda
khas pada bagian genom Yasminingsih, 2009. Penanda RAPD telah banyak digunakan untuk mempelajari keanekaragaman genetik seperti, jeruk Karsinah et
al., 2002, jarak pagar Yasminingsih, 2009, mentimun Julisaniah et al., 2008 dan kelapa Roslim, 2003.
10
BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN
3.1. Waktu dan Lokasi
Penelitian ini dilakukan pada bulan Juli 2014 hingga Februari 2015 di Laboratorium Terpadu dan Laboratorium Genetika, Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara.
3.2. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah water bath, shaker, spin down, nanophotometer, UV transluminator, PCR Polymerase Chain Reaction,
elektroforesis, sentrifugasi, freezer, pipet mikro, tip, mortar dan porselin, hot plate, autoklaf, neraca analitik, tabung ependorf, erlenmeyer, alumunium foil,
gunting, kertas label. Bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah pucuk daun
markisa. Bahan kimia yang digunakan adalah buffer ekstraksi CTAB 100 mM Tris HCL, 4M Nacl, 20 mM EDTA, 3 CTAB, 6 PVP dan 0,2 β-
merkaptoetanol, Kloroform, Isoamilalkohol, Isopropanol, Alkohol 70, 5 M NaCl, sodium asetat, Fenol, Buffer TE, TAE 1X, Agarose, Promega GoTaq®
Green Master Mix, ddH
2
0 steril, primer RAPD Tabel 3.1., Ethium bromide 1, Loading dye 6X, RNA-se, Proteinase-K.
3.3. Prosedur Penelitian 3.3.1. Pengkoleksian Sampel
Sampel tanaman markisa dikoleksi dari 4 kabupaten di Sumatera Utara yaitu kabupaten Karo, kabupaten Simalungun,
kabupaten HUMBAHAS Humbang Hasundutan dan kabupaten Tapanuli Utara yang merupakan daerah
pembudidaya tanaman markisa secara komersial. Jenis markisa yang dikoleksi adalah markisa asam ungu Passiflora edulis Sims., markisa asam kuning
