telah kering dilarutkan dengan ddH20 steril.
3.3.3. Uji Kualitas dan Kuantitas DNA
Uji kualitas dan kuantitas DNA dilakukan untuk melihat konsentrasi dan kemurniannya
dengan menggunakan
nanophotometer IMPLEN
P-360 NanoPhotometer P-Class dan elektroforesis C.B.S. Scientific EPS-300 X
dengan menggunakan gel agarose 0,8. Dilakukan dengan menimbang 0,32 g bubuk agarose dan menambahkan 40 ml TAE 1X kemudian dipanaskan dengan
hot plate sampai mendidih warna larutan menjadi bening. Larutan agarose didinginkan sampai suhu ± 60 °C, kemudian dituangkan kedalam cetakan
elektroforesis yang telah disiapkan dan dibiarkan sampai memadat. Selanjutnya, larutan TAE 1X dimasukkan kedalam bak elektroforesis sampai gel agarose
terendam. Sampel DNA yang akan diuji diambil sebanyak 5 µl dan ditambahkan loading dye 6X sebanyak 1 µl, selanjutnya sampel yang telah disiapkan
dimasukkan dalam sumur gel dan dielektroforesis selama 30 menit pada voltase 70 V dan 100 mA. Hasil elektroforesis tersebut diwarnai dengan melakukan
perendaman pada larutan ethidium bromide EtBR 1 selama 15 menit kemudian direndam dalam aquades selama 10 menit. Kualitas DNA hasil
elektroforesis diamati di bawah UV transluminator G.BOX SYNGENE dan didokumentasikan dengan alat Kodak gel logic dengan software.
Uji kuantitas DNA dilakukan dengan pengukuran Kemurnian dan konsentrasi DNA dapat dihitung melalui perbandingan A
260
nm dan A
280
nm menggunakan nanophotometer IMPLEN P-360 NanoPhotometer P-Class.
3.3.4. Amplifikasi DNA dengan Teknik RAPD
Amplifikasi DNA genom markisa dilakukan jika sampel DNA sudah memenuhi kualitas dan kuantitas yang baik. Amplifikasi dilakukan dalam mesin
PCR Polymerase Chain Reaction menggunakan 7 primer acak Tabel 3.1.. Reaksi PCR menggunakan kit Promega GoTaq® Green Master Mix Tabel 3.2.
Tabel 3.1. Primer acak yang digunakan untuk analisis RAPD
No. Nama Primer
Sekuen Primer 5’ ---------------- 3’
Referensi
1. Akansha 7
CCTGGGTTCC Aukar et al., 2003
2. OPA 04
AATCGGGCTG Crochemore et al., 2003
3. OPB 08
GTCCACACGG Crochemore et al., 2003
4. OPB 18
CCACAGCAGT Crochemore et al., 2003
5. OPB 20
GGACCCTTAC Crochemore et al., 2003
6. OPB 19
ACCCCCGAAG Crochemore et al., 2003
7. AB11
GTGCGCAATG Fajardo et al., 1998
Reaksi amplifikasi selanjutnya dilakukan dengan memasukkan tabung yang telah berisi bahan untuk reaksi PCR ke dalam blok mesin PCR ependorf vapo protect
dengan waktu yang digunakan adalah: inisiasi denaturasi 95 °C selama 30 detik, selanjutnya denaturasi 95 °C selama 1 menit, annealing suhu optimum primer
34
o
C selama 30 detik, dan ekstension pada suhu 72 °C selama 1 menit, diikuti ekstension akhir pada suhu 72 °C selama 5 menit, pendinginan setelah siklus
selesai pada suhu 4
o
C. Reaksi PCR dilakukan sebanyak 40 siklus. Hasil reaksi PCR dielektroforesis pada 1,2 gel agarose. Elektroforesis dilakukan selama 90
menit pada tegangan 70 V, 500 mA pada suhu ruang. Pewarnaan hasil elektroforesis dilakukan dengan merendam agarose dalam larutan ethidium
bromide EtBR 1 selama 10 menit. Gel yang telah diwarnai kembali direndam dalam aquades steril selama 3 menit dan dilanjutkan pengamatan pita hasil
amplifikasi dengan menggunakan uv transiluminator G.BOX SYNGENE.
Tabel 3.2. Bahan untuk satu kali reaksi PCR No.
Komponen PCR Volume
1. GoTaq® Green Master Mix, 2X
10 µl 2.
DNA template 250 ng 2 µl
3. Primer 10 pmolµl
1 µl 4.
Nuclease free water 7 µl
Volume Akhir 20 µl
3.4. Analisis Data 3.4.1. Pita Polimorfik DNA
Kategori