BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN
3.1. Waktu dan Lokasi
Penelitian ini dilakukan pada bulan Juli 2014 hingga Februari 2015 di Laboratorium Terpadu dan Laboratorium Genetika, Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara.
3.2. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah water bath, shaker, spin down, nanophotometer, UV transluminator, PCR Polymerase Chain Reaction,
elektroforesis, sentrifugasi, freezer, pipet mikro, tip, mortar dan porselin, hot plate, autoklaf, neraca analitik, tabung ependorf, erlenmeyer, alumunium foil,
gunting, kertas label. Bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah pucuk daun
markisa. Bahan kimia yang digunakan adalah buffer ekstraksi CTAB 100 mM Tris HCL, 4M Nacl, 20 mM EDTA, 3 CTAB, 6 PVP dan 0,2 β-
merkaptoetanol, Kloroform, Isoamilalkohol, Isopropanol, Alkohol 70, 5 M NaCl, sodium asetat, Fenol, Buffer TE, TAE 1X, Agarose, Promega GoTaq®
Green Master Mix, ddH
2
0 steril, primer RAPD Tabel 3.1., Ethium bromide 1, Loading dye 6X, RNA-se, Proteinase-K.
3.3. Prosedur Penelitian 3.3.1. Pengkoleksian Sampel
Sampel tanaman markisa dikoleksi dari 4 kabupaten di Sumatera Utara yaitu kabupaten Karo, kabupaten Simalungun,
kabupaten HUMBAHAS Humbang Hasundutan dan kabupaten Tapanuli Utara yang merupakan daerah
pembudidaya tanaman markisa secara komersial. Jenis markisa yang dikoleksi adalah markisa asam ungu Passiflora edulis Sims., markisa asam kuning
Passiflora edulis f. flavicarpa Deg., markisa asam merah Passiflora edulis f. edulis Sims., markisa konyal Passiflora ligularis L., markisa erbis Passiflora
quadrangularis, F1 markisa ungu besar hasil persilangan antara markisa ungu dengan markisa merah dan markisa liar Passiflora foetida Lampiran 1..
3.3.2. Isolasi DNA
DNA diisolasi dari bagian daun yang masih muda bagian pucuk dengan menggunakan metode CTAB Doyle Doyle, 1990 yang dimodifikasi oleh Lade
et al. 2014, Sebanyak 0,5 g daun muda digerus dalam cawan porselin dengan menambahkan 1 ml buffer CTAB 100 mM Tris HCL, 4M Nacl, 20 mM EDTA,
3 CTAB, 6 PVP dan 0,2 β-merkaptoetanol tanpa menggunakan nitrogen cair. Hasil gerusan dipindahkan kedalam tabung eppendorf 2 ml. Ditambahkan
RNase 1 µl dari 10 mgml kemudian inverted dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 15 menit. Kemudian ditambahkan 10 µl Proteinase-K 1 mgml dan
diinkubasi dalam waterbath pada suhu 65
o
C selama 1 jam inverted 15 menit sekali, setelah itu didiamkan di suhu ruang.
Proses pemurnian diawali dengan penambahan klorofom: isoamilalkohol 24:1 hingga mencapai 1 kali volume sampel, kemudian dihomogenkan dengan
dibolak-balik inverted kemudian disentrifuse eppendorf centrifuge 5430R dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4 °C. Supernatan
diambil dengan pipet mikro dan dipindahkan ke eppendorf baru yang steril. Ditambahkan 5 M NaCl sebanyak setengah volume supernatan dan diinkubasi di
es selama 15 menit. Sodium asetat ditambahkan sebanyak 110 volume supernatan dan isopropanol dingin sampai tube penuh inverted secara perlahan, dilihat
adanya benang-benang halus dari DNA. Selanjutnya larutan tersebut diendapkan dengan cara diinkubasi pada suhu -20 °C selama 1 jam. Larutan disentrifuse
eppendorf centrifuge 5430R dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4 °C, dan cairan dibuang hingga terlihat endapan DNA berupa pelet pada
ujung eppendorf. Endapan yang merupakan DNA dicuci dengan alkoholEtOH 70, kemudian disentrifuse eppendorf centrifuge 5430R kembali dengan
kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4°C. AlkoholEtOH dibuang dan pelet DNA dikeringkan pada suhu ruangan dengan posisi terbalik. DNA yang
telah kering dilarutkan dengan ddH20 steril.
3.3.3. Uji Kualitas dan Kuantitas DNA
Uji kualitas dan kuantitas DNA dilakukan untuk melihat konsentrasi dan kemurniannya
dengan menggunakan
nanophotometer IMPLEN
P-360 NanoPhotometer P-Class dan elektroforesis C.B.S. Scientific EPS-300 X
dengan menggunakan gel agarose 0,8. Dilakukan dengan menimbang 0,32 g bubuk agarose dan menambahkan 40 ml TAE 1X kemudian dipanaskan dengan
hot plate sampai mendidih warna larutan menjadi bening. Larutan agarose didinginkan sampai suhu ± 60 °C, kemudian dituangkan kedalam cetakan
elektroforesis yang telah disiapkan dan dibiarkan sampai memadat. Selanjutnya, larutan TAE 1X dimasukkan kedalam bak elektroforesis sampai gel agarose
terendam. Sampel DNA yang akan diuji diambil sebanyak 5 µl dan ditambahkan loading dye 6X sebanyak 1 µl, selanjutnya sampel yang telah disiapkan
dimasukkan dalam sumur gel dan dielektroforesis selama 30 menit pada voltase 70 V dan 100 mA. Hasil elektroforesis tersebut diwarnai dengan melakukan
perendaman pada larutan ethidium bromide EtBR 1 selama 15 menit kemudian direndam dalam aquades selama 10 menit. Kualitas DNA hasil
elektroforesis diamati di bawah UV transluminator G.BOX SYNGENE dan didokumentasikan dengan alat Kodak gel logic dengan software.
Uji kuantitas DNA dilakukan dengan pengukuran Kemurnian dan konsentrasi DNA dapat dihitung melalui perbandingan A
260
nm dan A
280
nm menggunakan nanophotometer IMPLEN P-360 NanoPhotometer P-Class.
3.3.4. Amplifikasi DNA dengan Teknik RAPD
Amplifikasi DNA genom markisa dilakukan jika sampel DNA sudah memenuhi kualitas dan kuantitas yang baik. Amplifikasi dilakukan dalam mesin
PCR Polymerase Chain Reaction menggunakan 7 primer acak Tabel 3.1.. Reaksi PCR menggunakan kit Promega GoTaq® Green Master Mix Tabel 3.2.
Tabel 3.1. Primer acak yang digunakan untuk analisis RAPD
No. Nama Primer
Sekuen Primer 5’ ---------------- 3’
Referensi
1. Akansha 7
CCTGGGTTCC Aukar et al., 2003
2. OPA 04
AATCGGGCTG Crochemore et al., 2003
3. OPB 08
GTCCACACGG Crochemore et al., 2003
4. OPB 18
CCACAGCAGT Crochemore et al., 2003
5. OPB 20
GGACCCTTAC Crochemore et al., 2003
6. OPB 19
ACCCCCGAAG Crochemore et al., 2003
7. AB11
GTGCGCAATG Fajardo et al., 1998
Reaksi amplifikasi selanjutnya dilakukan dengan memasukkan tabung yang telah berisi bahan untuk reaksi PCR ke dalam blok mesin PCR ependorf vapo protect
dengan waktu yang digunakan adalah: inisiasi denaturasi 95 °C selama 30 detik, selanjutnya denaturasi 95 °C selama 1 menit, annealing suhu optimum primer
34
o
C selama 30 detik, dan ekstension pada suhu 72 °C selama 1 menit, diikuti ekstension akhir pada suhu 72 °C selama 5 menit, pendinginan setelah siklus
selesai pada suhu 4
o
C. Reaksi PCR dilakukan sebanyak 40 siklus. Hasil reaksi PCR dielektroforesis pada 1,2 gel agarose. Elektroforesis dilakukan selama 90
menit pada tegangan 70 V, 500 mA pada suhu ruang. Pewarnaan hasil elektroforesis dilakukan dengan merendam agarose dalam larutan ethidium
bromide EtBR 1 selama 10 menit. Gel yang telah diwarnai kembali direndam dalam aquades steril selama 3 menit dan dilanjutkan pengamatan pita hasil
amplifikasi dengan menggunakan uv transiluminator G.BOX SYNGENE.
Tabel 3.2. Bahan untuk satu kali reaksi PCR No.
Komponen PCR Volume
1. GoTaq® Green Master Mix, 2X
10 µl 2.
DNA template 250 ng 2 µl
3. Primer 10 pmolµl
1 µl 4.
Nuclease free water 7 µl
Volume Akhir 20 µl
3.4. Analisis Data 3.4.1. Pita Polimorfik DNA
DNA hasil PCR diterjemahkan kedalam data biner berdasarkan ada tidaknya pita, dengan ketentuan nilai 0 nol untuk tidak ada pita, dan nilai 1
satu untuk adanya pita pada suatu posisi yang sama dari setiap individu yang dibandingkan. Cara pemberian nilai dapat dilihat pada Gambar 3.1.
No A B C D E No A B C D E
Gambar 3.1. Pola Terjemahan Pita DNA
3.4.2. Analisis Similaritas
Data biner pita DNA diproses dengan bantuan program Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System NTSYS ver. 2.11a. Hasil analisis ini
disajikan dalam bentuk pohon dendogram. Untuk melihat persentase pita polimorfik dengan menggunakan rumus:
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Analisis Kualitatif dan Kuantitatif Pita Hasil Isolasi DNA Tanaman Markisa
Hasil isolasi DNA genom dari 31 sampel markisa dielektroforesis pada gel agarose 0,8. Uji ini dilakukan untuk mengetahui kualitas pita DNA yang
diperoleh sehingga dapat digunakan untuk proses PCR. Hasil elektroforesis DNA genom menunjukkan adanya satu pita utuh pada setiap sumur gel.
M 1
2 3
4 5
6 7
8 9
10 11
12 13
14 15
M 16
17 18
19 20
21 2 2
23 24
25 26
27 28
29 30
31
Gambar 4.1. Hasil elektoforesis DNA genom
dari 30
sampel markisa
menggunakan gel agarose 0,8. Nomor 1-30 = aksesi markisa Lampiran 1.
Pita utuh DNA genom ini ditandai dengan tidak adanya smear DNA tidak terdegradasi dan terkontaminasi. Ukuran pita DNA genom yang didapat adalah
diatas 10000 bp. Menurut Aulia 2014, ciri DNA yang utuh pada elektroforesis adalah DNA dapat bermigrasi pada pori-pori agarose dalam buffer pada arus
tertentu dan tidak tercacah smear. Menurut Syafaruddin Santoso 2011, DNA yang utuh ditandai dengan tidak adanya smear DNA yang dielektroforesis. Hal ini
10000 bp
10000 bp
menjadi penting karena pada proses PCR, DNA yang masih utuh akan lebih memberikan hasil yang relatif lebih akurat.
Hasil pengukuran kuantitas dan kemurnian dari 31 DNA genom markisa dengan nanofotometer IMPLEN P-360 NanoPhotometer P-Class menunjukkan
kemurnian DNA yang baik dan kuantitasnya yang cukup Lampiran 2. Kemurnian yang diperoleh berkisar antara 1,368-2,112. Menurut Sambrook
Russel 1989, batas kemurnian yang biasa digunakan dalam analisis molekuler pada rasio A
260
A
280
adalah 1,8-2,0. Kemurnian yang diperoleh tidak semuanya memenuhi batas kriteria untuk dapat digunakan dalam analisis molekuler 1,8,
namun pada penelitian yang telah dilakukan oleh Minarsih et al., 2011, terhadap keragaman genetik Ganoderma spp., nilai kemurnian 1,069 merupakan nilai
terendah tetapi sudah dapat digunakan untuk proses PCR-RAPD. Selain itu pada penelitian yang telah dilakukan oleh Bayzura 2014 Aulia 2014 terhadap
tanaman kelapa sawit, nilai kemurnian 1,5 - 1,7 sudah dapat digunakan untuk melakukan proses PCR-RAPD. Rendahnya nilai rasio A
260
A
280
1,8, dapat disebabkan oleh kontaminasi protein dan bahan organik lainnya sebaliknya
kontaminasi fenol ditandai dengan tingginya nilai rasio tersebut 2,0 Linacero et al., 1998.
Konsentrasi DNA genom markisa yang diperoleh berkisar antara 42,5 sampai 2552 ngµl. Konsentarsi DNA yang biasanya digunakan dalam proses
PCR adalah 0,5-50 ngµl, maka konsentrasi yang didapatkan pada penelitian ini sudah cukup memenuhi syarat dalam melakukan RAPD. Menurut Haris et al.
2003, konsentrasi DNA akan berdampak pada kualitas fragmen hasil amplifikasi. Konsentrasi DNA yang rendah akan menghasilkan fragmen yang
tipis, sebaliknya konsentrasi DNA yang tinggi akan menyebabkan fragmen terlihat tebal sehingga sulit membedakan antar fragmen.
4.2. Analisis Profil Pita RAPD Tanaman Markisa
Kategori