18 perhitungan mikroskopis langsung Direct Microscopic Count menggunakan
mikroskop epifluoresen berdasarkan Parizzi et al. 2004. Pada analisis densitas biofilm C. sakazakii mutan GFPuv FWHd16 dan YRt2a, permukaan kontak
pangan dibilas terlebih dahulu dengan GF steril kemudian dilakukan perhitungan DMC sedangkan untuk jenis wild-type FWHd16 dan YRt2a, setelah permukaan
kontak pangan dibilas dengan GF steril kemudian pelat direndam dalam acridine orange 0.0026 persen Dewanti dan Wong, 1995 selama 5 menit dan dibilas
kembali dengan GF steril baru kemudian dilakukan DMC untuk menghitung densitas biofilm. Hasil perhitungan yang diperoleh dinyatakan dalam bentuk Log
CFUcm
2
. Enumerasi densitas biofilm C. sakazakii mutan GFPuv FWHd16 dan YRt2a
juga dilakukan menggunakan metode pemupukan tuang berdasarkan Yunus 2000. Biofilm yang terbentuk pada permukaan kontak pangan selama waktu
inkubasi 24, 48, dan 72 jam diswab kemudian dipindahkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml larutan GF steril
dan 1 ml larutan Na-heksametafosfat lalu
divortex. Larutan kemudian diencerkan dan ditumbuhkan dengan menggunakan metode tuang pour plate dalam cawan petri steril berisi media TSAA kemudian
diinkubasi pada inkubator 37
o
C selama 24 jam. Jumlah koloni yang tumbuh dan berpendar hijau saat di bawah sinar UV pada cawan dihitung berdasarkan
Standard Plate Count BAM, 2001. Densitas biofilm pada masing-masing permukaan kontak pangan dinyatakan dalam Log CFUcm
2
. Pada analisis densitas biofilm multispesies, pelat SS dibilas dengan GF steril
kemudian dihitung populasi bakteri C. sakazakii mutan GFPuv yang menempel pada pelat SS di bawah mikroskop epifluoresen a. Setelah itu, pelat direndam
dalam acridine orange 0.0026 persen Dewanti dan Wong, 1995 selama 5 menit dan dibilas kembali dengan GF steril, kemudian dihitung kembali total populasi
bakteri yang terdapat pada pelat SS b. Selisih hasil dari perhitungan total populasi bakteri dengan jumlah populasi bakteri C. sakazakii mutan GFPuv b-a
merupakan jumlah bakteri S.aureus SA25923 atau L. rhamnosus R23 yang membentuk biofilm saat ditumbuhkan bersama dengan C. sakazakii mutan GFPuv
pada media yang sama.
Analisis Statistik
Semua eksperimen diulang dua kali dan duplo. Data diolah dengan ANOVA menggunakan SPSS untuk analisis sidik ragam dan uji Duncan untuk menentukan
perbedaan yang signifikan antara nilai rata-rata dari kelompok perlakuan.
4 HASIL DAN PEMBAHASAN Pembentukan Biofilm oleh
C. sakazakii Mutan GFPuv dan Wild-type pada Permukaan Kontak Pangan
Mutan C. sakazakii GFPuv FWHd16 dan YRt2a mampu membentuk biofilm pada ketiga jenis permukaan kontak pangan. Pengamatan yang dilakukan
19 dengan mikroskop epifluoresen terhadap C. sakazakii mutan GFPuv selama waktu
inkubasi memperlihatkan sel bakteri yang menempel pada permukaan kontak pangan. Sel bakteri mutan berlabel GFPuv tersebut tampak berwarna hijau
fluoresen saat diamati sehingga densitas biofilm yang terbentuk dapat dihitung. Pada biofilm C. sakazakii wild-type juga dilakukan pengamatan menggunakan
mikroskop epifluoresen untuk menghitung densitas biofilm yang terbentuk, namun sel wild-type memerlukan pewarnaan menggunakan acridine orange
terlebih dahulu Gambar 6. C. sakazakii wild-type FWHd16 dan YRt2a juga mampu membentuk biofilm pada ketiga jenis permukaan dan menghasilkan
visualisasi berwarna oranye saat diamati di bawah mikroskop epifluoresen.
Gambar 6
Pengamatan biofilm dengan mikroskop epifluoresen 1000x A
C. sakazakii mutan GFPuv FWHd16
, B
C. sakazakii mutan GFPuv YRt2a
, C
C. sakazakii wild-type FWHd16 dengan perwarnaan Acridine Orange
, D
C. sakazakii wild-type YRt2a dengan perwarnaan Acridine Orange
Densitas biofilm C. sakazakii mutan GFPuv FWHd16 yang terbentuk pada ketiga permukaan kontak pangan, yakni SS, Buna-N, dan PTFE dapat dilihat pada
Gambar 7. Hasil pengamatan menunjukkan densitas berada pada kisaran 4.94 –
5.11 Log CFUcm
2
, 4.80 –5.22 Log CFUcm
2
dan 4.66 –4.87 Log CFUcm
2
untuk waktu inkubasi 24 jam, 48 jam dan 72 jam. Densitas biofilm pada SS dan PTFE
mencapai jumlah tertinggi pada waktu inkubasi 48 jam namun kemudian menurun saat inkubasi 72 jam. Sementara itu, pada Buna-N densitas biofilm tertinggi
dicapai pada waktu inkubasi 24 jam dan mengalami penurunan setelahnya.
20
Gambar 7 Densitas biofilm C. sakazakii mutan GFPuv FWHd16 pada permukaan
kontak pangan Pembentukan biofilm mutan lainnya, yakni C. sakazakii mutan GFPuv
YRt2a dapat dilihat pada Gambar 8. Densitas biofilm yang terbentuk pada SS, Buna-N, dan PTFE selama waktu inkubasi 24 jam, 48 jam dan 72 jam ada pada
kisaran 4.94 –5.15 Log CFUcm
2
, 4.86 –4.98 Log CFUcm
2
dan 4.60 –4.76 Log
CFUcm
2
. Pada biofilm C. sakazakii mutan GFPuv YRt2a densitas tertinggi dihasilkan pada inkubasi 24 jam dan kemudian menurun setelahnya. Biofilm
tertinggi terbentuk pada permukaan PTFE dan terendah pada permukaan Buna-N.
Gambar 8 Densitas biofilm C. sakazakii mutan GFPuv YRt2a pada permukaan
kontak pangan Biofilm pada PTFE memiliki densitas yang lebih tinggi dibandingkan pada
kedua permukaan kontak pangan lainnya. Hal ini disebabkan oleh sifat PTFE yang lebih hidrofobik. Sinde dan Carballo 2000 dalam penelitiannya melaporkan
bahwa Salmonella spp. dan L. monocytogenes lebih banyak menempel pada permukaan PTFE yang lebih hidrofobik daripada Buna-N dan stainless steel.
4.50 4.60
4.70 4.80
4.90 5.00
5.10 5.20
5.30
24 48
72
De n
sitas B iof
il m
L og CF
Uc m
2
Waktu Inkubasi Jam SS
Buna PTFE
4.50 4.60
4.70 4.80
4.90 5.00
5.10 5.20
24 48
72
De n
sitas B iof
il m
Log C F
U c
m
2
Waktu Inkubasi Jam SS
Buna PTFE
21 Beberapa penelitian menyebutkan bahwa bakteri cenderung lebih mudah
menempel pada permukaan hidrofobik, interaksi hidrofobik bakteri terhadap permukaan padat saat tumbuh pada media dengan keterbatasan nutrisi akan
meningkat karena terjadinya perubahan morfologi ukuran sel bakteri menjadi lebih kecil yanng diikuti dengan peningkatan hidrofobisitas dan agregasi sel
bakteri sehingga mempermudah proses transfer dan penempelan bakteri pada permukaan Dewanti dan Wong, 1995. Interaksi hidrofobik antara bakteri dengan
substrat pada permukaan kontak pangan menyebabkan sel menempel dan tidak dapat balik sehingga bertahan pada permukaan tersebut Donlan, 2002. Biofilm C.
sakazakii mutan GFPuv, baik dari galur FWHd16 atau YRt2a memiliki densitas tertinggi pada permukaan PTFE dan terendah pada Buna-N. Rendahnya densitas
biofilm pada Buna-N diduga disebabkan adanya komponen dalam Buna-N yang dapat
menghambat pertumbuhan
organisme sehingga
mempengaruhi pembentukan biofilm pada permukaan Wong, 1998. Senyawa nitril telah
terbukti dapat menghambat pertumbuhan beberapa Mycobacteria Sanna et al. 2000. Salah satu jenis senyawa nitril, yakni acrylonitril adalah prekursor yang
digunakan dalam karet sintesis dan merupakan komponen dalam buna-N yang bersifat toksin Reyes et al. 2000 disinyalir dapat menghambat pertumbuhan
mikroorganisme. Reyes et al. 2000 menunjukkan bahwa keberadaan acrylonitril pada media pertumbuhan bakteri dapat menyebabkan terjadinya autolisis bakteri B.
subtilis.
C. sakazakii wild type FWHd16 juga membentuk biofilm pada semua jenis permukaan kontak pangan Gambar 9. Densitas biofilm C. sakazakii wild-type
FWHd16 yang terbentuk pada 24 jam, 48 jam dan 72 jam berturut-turut adalah 5.01
–5.24 Log CFUcm
2
, 5.02 –5.34 Log CFUcm
2
, dan 4.91 –5.22
CFUcm
2
. Biofilm yang terbentuk pada semua jenis kontak permukaan pangan mengalami
peningkatan densitas hingga waktu inkubasi 48 jam dengan densitas tertinggi terjadi pada permukaan PTFE.
Gambar 9 Densitas biofilm C. sakazakii FWHd16 wild-type pada permukaan
kontak pangan
4.70 4.80
4.90 5.00
5.10 5.20
5.30 5.40
24 48
72
De n
sitas B iof
il m
L og CF
Uc m
2
Waktu Inkubasi Jam SS
Buna PTFE
