Enzim Protease TINJAUAN PUSTAKA

3.3 Tahapan Penelitian

Penelitian dilakukan dalam 2 bagian, yaitu penelitian pendahuluan dan penelitian utama. Penelitian pendahuluan yaitu melakukan proses demineralisasi menggunakan HCl dan penelitian utama adalah mengekstraksi karotenoid menggunakan enzim papain dan enzim pepsin kemudian mengkarakterisasi hasil ekstraksi sebagai antioksidan.

3.3.1 Penelitian pendahuluan

Penelitian pendahuluan ini dilakukan proses demineralisasi menggunakan HCl yang berfungsi untuk mengurangi jumlah mineral, seperti kalsium. Kepala udang yang mentah dibersihkan dan dicuci menggunakan air sampai bersih dan dikukus sampai berubah warna kemerahan selama 10 menit. Proses demineralisasi dilakukan dengan cara merendam kepala udang dengan menggunakan HCl pada konsentrasi 0; 0,75; 1,00, dan 1,25 M selama 30 menit dengan perbandingan 1:4 bv limbah kepala udang : larutan HCl. Kepala udang yang telah direndam dalam HCl kemudian dicuci menggunakan air bersih sampai pH netral kemudian dianalisis kadar air, abu, protein, dan lemak. Proses demineralisasi kepala udang dapat dilihat pada Gambar 6. Gambar 6 Proses demineralisasi kepala udang Turana 1997. Kepala udang Demineralisasi Penambahan HCl 0; 0,75; 1,00 dan 1,25 M kulit udang : HCl 1:4, selama 30 menit Pembersihan dan Pencucian Pengukusan Kepala udang hasil demineralisasi

3.3.2 Penelitian utama

Ekstraksi karotenoid dari kepala udang dilakukan menggunakan enzim papain dan enzim pepsin yang merupakan modifikasi dari metode Babu et al. 2008. Diagram alir proses ekstraksi pigmen karotenoid dari kepala udang dapat dilihat pada Gambar 7. Gambar 7 Proses ekstraksi karotenoid dari kepala udang Babu et al. 2008 Keterangan: = proses yang dilakukan, = bahan. Kepala Udang Pemanasan suhu 100 °C 10 menit Karotenoid Pembekuan suhu -18 °C Ekstraksi menggunakan enzim pepsin 2, 3 dan 4 pH 4 dan suhu 45 °C selama 2 jam Agitasi 2 jam dalam keadaan gelap Demineralisasi HCl 1,25 M, selama 30 menit Ekstraksi menggunakan enzim papain 4, 6 dan 8 pH 6,2 dan suhu 55 °C selama 2 jam Penyaringan Filtrat Residu Inkubasi 24 jam, suhu 28 + 2 °C Penyaringan Kepala udang diagitasi dalam larutan enzim papain menggunakan pelarut buffer fosfat-sitrat dengan konsentrasi 4, 6, dan 8 bb selama 2 jam pH 6.2 dan suhu 55 °C atau pepsin pH 4 dan suhu 45 °C menggunakan pelarut bufer fosfat-sitrat dengan konsentrasi 2, 3, dan 4 bb selama 2 jam. Larutan disaring menggunakan penyaring yang berukuran pori 5-10 µm dan filtratnya dipanaskan selama 10 menit pada suhu 100 °C dan didiamkan selama 24 jam pada suhu 28 + 2 °C, kemudian filtrat disaring menggunakan kertas whatman 41 dan dibekukan pada suhu -18 °C. Filtrat yang sudah beku kemudian freeze drying kering.

3.4 Prosedur Analisis

3.4.1 Analisis kadar air AOAC 2000 Sampel yang sudah homogen ditimbang 2 g dan diletakkan di dalam cawan kosong yang sudah ditimbang beratnya, cawan dan tutupnya sudah dikeringkan di dalam oven serta didinginkan di dalam desikator. Cawan yang berisi sampel kemudian ditutup dan dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 100 °C selama 5 jam atau sampai beratnya konstan. Cawan lalu didinginkan di dalam desikator dan setelah dingin cawan ditimbang. Kadar air dapat dihitung dengan rumus: Kadar air wet basis = 100 W1 W2 - W1 Keterangan: W1 = berat sampel awal g W2 = berat sampel setelah dikeringkan g 3.4.2 Analisis kadar abu AOAC 2000 Sampel sebanyak 2 g dimasukkan ke dalam cawan pengabuan yang telah ditimbang dan dibakar di dalam tanur serta didinginkan dalam desikator. Cawan yang berisi sampel dimasukkan ke dalam tanur pengabuan dan dibakar sampai diperoleh abu berwarna keabu-abuan. Suhu pemanasan dinaikkan secara bertahap sampai suhu mencapai 650 °C dan dibiarkan selama 1 jam. Setelah suhu tungku pengabuan turun sekitar 200 °C, cawan yang berisi abu tersebut didinginkan di dalam desikator selama 30 menit dan kemudian ditimbang beratnya. Perlakuan ini diulang sampai mencapai berat yang konstan. Kadar abu dapat dihitung dengan rumus: Kadar abu total = 100 g sampel Berat g abu Berat 3.4.3 Analisis kadar lemak AOAC 2000 Labu lemak dikeringkan dalam oven, didinginkan dalam desikator kemudian ditimbang. Sebanyak 5 g sampel dibungkus kertas saring, kemudian dimasukkan ke dalam alat ekstruksi soxhlet. Pelarut lemak dituangkan secukupnya ke dalam labu lemak. Refluks dilakukan selama minimum 5 jam sampai pelarut yang turun kembali ke dalam labu lemak berwarna jernih. Pelarut yang ada di labu lemak tersebut didestilasi, labu yang berisi hasil ekstraksi dipanaskan dalam oven pada suhu 100 ºC selama 60 menit atau sampai beratnya tetap. Labu lemak yang telah didinginkan dalam desikator, lalu ditimbang sampai memperoleh berat yang konstan. Berat lemak dapat dihitung dengan rumus: 100 g sampel Berat g lemak Berat lemak Kadar 3.4.4 Analisis kadar protein AOAC 2000 Penentuan kadar protein dilakukan dengan metode mikrokjeldahl. Sampel ditimbang sebanyak 0,5 g, kemudian dimasukkan ke dalam labu destruksi, ditambahkan kjeltab dan 10 mL H 2 SO 4 pekat. Sampel didestruksi sampai terbentuk larutan hijau bening. Larutan dibiarkan sampai dingin lalu dipindahkan ke dalam alat destilasi. Labu kjeldahl dicuci menggunakan akuades kemudian larutan tersebut dimasukkan ke dalam alat destilasi dan ditambahkan 20 mL NaOH pekat sampai berwarna coklat kehitaman, kemudian didestilasi. Destilat ditampung ke dalam erlenmeyer 125 mL yang berisi 10 mL H 3 BO 3 4 dan 2 tetes indikator campuran metilen merah dan metilen biru sampai berwarna hijau kebiruan, destilasi dihentikan dan destilat dititrasi dengan HCl 0,02 N sampai berwarna merah muda. Larutan blanko dianalisis seperti contoh. Kadar protein dapat dihitung dengan rumus: 25 , 6 N protein Kadar 100 sampel mg 14,007 HCl N blanko mL - HCl mL N Kadar 3.4.5 Uji aktivitas enzim Bergmeyer 1983 Aktivitas enzim papain dan pepsin diuji berdasarkan jumlah tirosin yang dibebaskan oleh substrat. Substrat kasein dan standar yang digunakan adalah tirosin. Perlakuan penentuan suhu optimum papain maka larutan diinkubasi pada suhu 45, 50, 55, 60, dan 65 o C dengan pH buffer 6, sedangkan perlakuan penentuan suhu optimum pepsin larutan diinkubasi pada suhu 35, 40, 45, 50, dan 55 °C dengan pH buffer 4,5. Perlakuan penentuan pH optimum papain maka larutan diinkubasi dilakukan dengan menggunakan pH buffer 5,8; 6,0; 6,2; 6,4; dan 6,6 dengan suhu optimum yang telah diketahui sedangkan perlakuan penentuan pH optimum pepsin larutan diinkubasi dengan menggunakan pH buffer 4,1; 4,3; 4,5; 4,7; dan 4,9 dengan suhu optimum yang telah diketahui. Untuk setiap sampel yang dianalisis, harus disertai dengan blanko dan standar, dengan perincian seperti pada Tabel 4. Tabel 4 Uji aktivitas enzim Pereaksi Sampel ml Blanko ml Standar ml Buffer fosfat citrate 0,01 M 1.0 1.0 1.0 Substrat 2 1.0 1.0 1.0 Enzim dalam CaCl 2 10 mmoll 0.2 - - Standar Tirosin - - 0.2 Akuades - 0.2 - Inkubasi pada perlakuan selama 10 menit TCA 0,1 M 2.0 2.0 2.0 CaCl 2 0.2 - - Enzim dalam CaCl 2 10 mmoll - 0.2 0.2 Didiamkan pada suhu sesuai perlakuan selama 10 menit lalu disaring dengan kertas saring Filtrat 1.50 1.50 1.50 Na2CO3 0,4 M 5.00 5.00 5.00 Pereaksi Folin 1.00 1.00 1.00 Didiamkan selama 20 menit pada suhu sesuai perlakuan Diukur dengan spektrofotometer pada = 578 nm enzim pepsin dan = 650 nm enzim papain. Sumber : Bergemeyer 1983