Uji Aktivitas Antioksidan Metode 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil DPPH

konsentrasi 50, 100, 150, 200, 250, dan 300 mgL asam galat. Larutan asam galat ditambahkan 1 mL reagen Folin Ciocalteu lalu dikocok. Larutan didiamkan selama 8 menit tambah 3 mL larutan Na 2 CO 3 dikocok sampai homogen kemudian didiamkan selama 2 jam pada suhu kamar. Larutan diukur absorbansinya pada panjang gelombang serapan maksimum 765 nm, lalu dibuat kurva kalibrasinya hubungan antara konsentrasi asam galat mgL dengan absorban. 3.4.8 Penentuan komposisi beta karoten Zhao et al. 2004 Kadar beta karoten ditentukan dengan metode HPLC. Sampel dielusi dengan HPLC Shimadzu Liquid Chromatograph, kolom C 18 15 cm x 4 mm, detector UV-VIS Photodiode Array, dengan fasa gerak metanol : asetonitril : tetrahidrofuran 75:20:5 pada kecepatan alir 1,2 mLmenit. Eluen dimonitor menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 400 nm. 3.4.9 Penentuan komposisi astaxanthin Lee et al. 1999 Kadar astaxanthin ditentukan dengan menggunakan metode HPLC. Sampel sebanyak 0,3 mL direaksikan dalam 5 mL aseton kemudian diinjeksikan dalam HPLC melalui kolom ODS 25 cm X 4,6 mm dengan ukuran partikel 5µm. Sampel dielusi menggunakan campuran metanol : diklorometan : asetonitril : air 67,5:22,5:9,5:0,5 dengan daya alir 1 mLmnt. Eluen dimonitor menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 450 nm. 3.4.10 Uji aktivitas antioksidan metode 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil DPPH Okawa 2001 Ekstrak ditimbang sebanyak 10 mg, kemudian dilarutkan dengan 10 mL metanol dalam labu ukur 10 mL, maka didapatkan konsentrasi 1 mgmL. Pengenceran dilakukan dengan menambahkan metanol sehingga diperoleh sampel dengan konsentrasi 10, 30, 50, 70, 90 gmL. Penentuan aktivitas antioksidan masing-masing konsentrasi dipipet sebanyak 0,2 mL larutan sampel dengan pipet mikro dan dimasukan ke dalam vial, kemudian tambahkan 3,8 mL larutan DPPH 50 M. Campuran dihomogenkan dan dibiarkan selama 30 menit ditempat gelap, serapan diukur dengan spektrofotometer UV - Vis pada panjang gelombang 515 nm, sebagai pembanding digunakan asam askorbat konsentrasi 2,3,4,5,6 gmL dengan perlakuan yang sama dengan sampel uji. Aktivitas antioksidan sampel ditentukan oleh besarnya hambatan serapan radikal DPPH melalui perhitungan persentase inhibisi serapan DPPH dengan menggunakan rumus : Inhibisi = 100 kontrol A sampel A - kontrol A Keterangan : A kontrol = Serapan radikal DPPH 50 M pada panjang gelombang 515 nm. A Sampel = Serapan sampel radikal DPPH 50 M pada panjang gelombang 515 nm. Aktivitas antioksidan juga dapat diekspresikan dalam ascorbic acid equivalent antioxidant capacity AEAC Leong dan Shui 2002 menggunakan persamaan sebagai berikut : AEAC = -AA x [ ] AAmgmL mL Keterangan : A0 = Absorbansi kontrol A1 = Absorbansi sampel AA = Asam Askorbat Perhitungan IC 50 atau inhibiton concentration berdasarkan pada persamaan berikut : IC 50 = IC 50 askorbat AEAC mgAA 100 g 100.000

3.5 Rancangan Percobaan dan Analisis Data

Pada penelitian ini variabel proses yang diduga berpengaruh terhadap kualitas astaxanthin yang dihasilkan adalah konsentrasi HCl dan konsentrasi enzim. Pada proses demineralisasi dicobakan HCl pada empat konsentrasi yaitu 0; 0,75; 1,00; dan 1,25 dengan tiga kali ulangan. Pada proses ekstraksi astaxanthin dicobakan dua jenis enzim yaitu pepsin dengan tiga taraf konsentrasi yaitu 2, 3, dan 4 dan papain dengan tiga taraf konsentrasi yaitu 4, 6, dan 8. Ulangan dilakukan sebanyak tiga kali. Rancangan percobaan yang digunakan untuk melihat pengaruh HCl dan pengaruh konsentrasi enzim adalah rancangan acak lengkap faktor tunggal dengan model linier Torrie Steel 1995. Persamaan yang digunakan adalah: Y ij = µ + A i + ε ij Keterangan: Y ij = Respon percobaan karena pengaruh faktor A taraf ke-i, ulangan ke-j = Nilai tengah umum atau rataan A i = Pengaruh taraf ke-i i = 0; 0,75; 1,00; dan 1,25 M atau i = , 2, 3, dan 4 atau i = 4, 6, dan 8 dimana faktor A A = Konsentrasi HCl atau enzim pepsin atau papain ε ij = Kesalahan percobaan karena pengaruh faktor ke-A taraf ke-i pada ulangan ke-j j= 1, 2, 3 Jika hasil analisis berbeda nyata, dilanjutkan uji lanjut Tukey w. Rumus yang digunakan: w = q α p,f e S Y Keterangan: q α = Y maks – Y min S Y ; f e = derajat bebas galat p = t adalah banyaknya perlakuan; S Y = s n 12