e. Reagen ALT Reagen yang digunakan adalah reagen ALT DiaSys.
Komposisi dan konsentrasi dari reagen ALT adalah sebagai berikut Tabel I.
Tabel I. Komposisi dan konsentrasi reagen ALT Komposisi
pH Konsentrasi
R1 : TRIS 7,15
140 mmolL L-Alanine
700 mmolL LDH lactate dehydrogenase
≥ 2300 UL
R2 : 2-Oxoglutarate 85 mmolL
NADH 1 mmolL
Pyroxidal-5 phospate FS: Good’s buffer
Pyridoxal-5-phosphate pH
9,6 100 mmolL
13 mmolL
f. Reagen AST yang digunakan adalah reagen AST DiaSys. Komposisi dan
konsentrasi dari reagen AST adalah sebagai berikut Tabel II.
Tabel II. Komposisi dan konsentrasi reagen AST Komposisi
pH Konsentrasi
R1 : TRIS 7,15
140 mmolL L-Aspartate
700 mmolL MDH malate dehydogenase
≥ 800 UL
LDH lactate dehydrogenase ≥
1200 UL R2 : 2-Oxoglutarate
65 mmolL NADH
1 mmolL Pyroxidal-5 phospate FS:
Good’s buffer Pyridoxal-5-phosphate
pH 9,6
100 mmolL 13 mmolL
D. Alat Penelitian
1. Alat infundasi Alat-alat infundasi yang digunakan terdiri dari alat-alat gelas berupa Beaker
glass, gelas ukur, labu ukur, pipet ukur, pipet tetes, batang pengaduk, panci
enamel, timbangan air.
2. Alat uji hepatoprote Alat-alat yang digu
alat gelas berupa B pipet tetes, batang
Centurion Scientifi 1cc, pipa kapiler,
stopwatch, blue tip
1. Determinasi herba Determinasi s
bagian Biologi Yogyakarta.
2. Pembuatan serbuk
Herba tempuy akar sebanyak 20
selama 12 jam hin potong menggunak
potong-potong dike selama 4-5 hari. S
menggunakan ayak an analitik, termometer, stopwatch, kain flanne
otektif igunakan dalam menguji efek hepatoprotektif ya
Beaker glass, gelas ukur, labu ukur, tabung re ang pengaduk Pyrex Iwaki Glass®,mikrop
tific®, vortex Genie Wilten®, spuit injeksi per r, tabung eppendorf, Vitalab mikro Microlab
tip dan yellow tip.
E. Tata Cara Penelitian
a i serbuk kering herba
Sonchus arvensis L.
Farmasi Fakultas Farmasi Universitas
uk kering herba Sonchus arvensis L. uyung berupa bagian batang, daun, dan bung
0 kg dicuci bersih dengan air mengalir dan di ingga tampak tidak basah lagi. Kemudian tana
akan pisau hingga berukuran 5-10 cm. Tanama ikeringkan pada oven untuk menguapkan air p
. Setelah kering, tanaman digiling hingga han akan nomor 40.
nnel, dan penangas
f yaitu seperangkat reaksi, pipet ukur,
opipet, sentrifuge eroral dan syringe
lab-200 Merck®,
dilakukan oleh s Gadjah Mada
unga tanpa bagian diangin-anginkan
anaman di potong- man yang sudah di
r pada suhu 50
o
C ancur, lalu diayak
3. Penetapan kadar air serbuk kering herba Sonchus arvensis L.
Serbuk kering herba Sonchus arvensis L. yang telah diayak melewati mesh 40, dimasukkan ke dalam alat moisture balance ± 5 g kemudian diratakan.
Bobot serbuk kering daun tersebut ditimbang sebagai bobot sebelum pemanasan bobot A, setelah itu dipanaskan pada suhu 105°C selama 15
menit. Serbuk kering herba Sonchus arvensis L. yang telah dipanaskan kemudian ditimbang kembali dan dihitung sebagai bobot setelah pemanasan
bobot B. Kemudian dilakukan perhitungan terhadap selisih bobot A dan bobot B yang merupakan kadar air serbuk herba Sonchus arvensis L.
4. Pembuatan infusa herba Sonchus arvensis L.
Sebanyak 7,5 g serbuk kering herba Sonchus arvensis L. dibasahi dengan aquadest hingga dua kali bobot serbuk 15 ml kemudian dicampur dalam 50,0
ml pelarut aquadest sehingga aquadest yang digunakan sebanyak 65,0 ml. campuran dipanaskan pada suhu 90
o
C selama 15 menit dalam panci enamel agar pemanasannya merata. Waktu 15 menit mulai dihitung ketika suhu
campuran sudah mencapai 90
o
C dan dijaga suhunya selama 15 menit. Setelah 15 menit dipanaskan dengan suhu 90
o
C, campuran diambil dan disaring serta diperas menggunakan kain flannel, dimasukkan ke dalam labu ukur hingga
didapatkan 50 ml larutan infundasi herba Sonchus arvensis L.. Dengan demikian, diperoleh infusa herba dengan konsentrasi 15.
5. Penetapan dosis infusa herba Sonchus arvensis L.
Dasar penetapan peringkat dosis adalah bobot tertinggi tikus, konsentrasi maksimum ekstrak dan pemberian cairan secara peroral separuhnya, yaitu 2,5
ml. Penetapan dosis tertinggi infundasi herba Sonchus arvensis L. adalah : D x BB = C x V
D x BB tertinggi tikus kgBB = C ekstrak mgml x 2,5ml D = x mgkg BB
Dua dosis lainnya diperoleh dengan menurunkan 2 dan 4 kalinya dari dosis tertinggi.
6. Pembuatan larutan karbon tetraklorida dalam olive oil
Pembuatan larutan tetraklorida dilakukan dengan perbandingan volume karbon tetraklorida dan pelarut sebesar 1:1
.
Pelarut yang digunakan untuk melarutkan karbon tetraklorida adalah olive oil. Karbon tetraklorida dilarutkan
dalam volume yang sama dengan olive oil. 7.
Uji pendahuluan. a.
Penetapan dosis hepatotoksin CCl
4
. Pemilihan dosis CCl
4
dilakukan untuk mengetahui pada dosis berapa CCl
4
bisa menyebabkan kerusakan hati tikus yang ditandai dengan peningkatan aktivitas ALT-AST serum paling tinggi tetapi tidak
menimbulkan kematian. b.
Penetapan waktu pencuplikan darah Waktu pencuplikan darah didapatkan dengan melakukan orientasi
dengan hewan uji. Ketiga ekor tikus uji diberikan dosis karbon
tetraklorida. Dari hewan uji diambil darah pada jam ke-0, 24, dan 48 setelah pemejanan tetraklorida, kemudian diukur aktivitas ALT dan AST.
8. Pengelompokan dan perlakuan hewan uji
Hewan percobaan yang dibutuhkan sebanyak 30 ekor tikus jantan dibagi secara acak dalam enam kelompok sama banyak. Kelompok I merupakan
kontrol hepatotoksin CCl
4
diberikan CCl
4
dalam olive oil 1:1 dengan dosis 2 mlkgBB secara intraperitonial. Kelompok II merupakan kontrol negatif yaitu
pemberian olive oil 2 mlkgBB secara intraperitonial. Kelompok III merupakan kontrol perlakuan yaitu pemberian infusa herba Sonchus arvensis L. secara per
oral, enam jam kemudian diambil darahnya dan dilakukan pengukuran aktivitas ALT-AST. Kelompok IV-VI diberikan infusa herba Sonchus arvensis L.,
kemudian pada 6 jam setelah perlakuan diberikan dosis CCl
4
. Pada jam ke-24
setelah diberi CCl
4
, kelompok kontrol hepatotoksin, kontrol negatif dan kelompok variasi dosis diambil darahnya pada daerah sinus orbitalis mata
tikus, kemudian ditampung dalam Eppendorf yang kemudian disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 3500 rpm dan bagian supernatannya
diambil untuk diukur aktivitas ALT-AST. 9.
Pengukuran Aktivitas ALT-AST Pengukuran aktivitas ALT-AST dilakukan dengan menggunakan alat
Micro-vitalab 200 yang telah divalidasi. Darah tikus yang sudah diambil didiamkan selama 5-10 menit kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3000
rpm selama 15 menit. Serum diambil dan dipindahkan ke Eppendorf dan sentrifugasi lagi dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit.
Serum diambil sebanyak 100 µl dan dicampur dengan 1000 µl reagen I, divortex dan didiamkan selama OT 2 menit, kemudian dicampur 500 µl reagen
II lalu divortex dan OT 1 menit. Setelah OT 1 menit serum tersebut kemudian diukur dengan mikro-vitalab.
F. Tata Cara Analisis Hasil
