Rancangan Penelitian Tempat dan Waktu Penelitian Batasan Operasional

BAB III METODE PENELITIAN

3.1. Rancangan Penelitian

Penelitian berupa penelitian analitik komparatif dengan pendekatan potong lintang.

3.2. Tempat dan Waktu Penelitian

Tempat penelitian di lakukan di Departement Obstetri dan Ginekologi FK. USU. RSUP. H Adam Malik Medan dan RS. Jejaring FK. USU Lainnya. Penelitian dimulai Desember 2013 sampai besar sampel terpenuhi. 3.3. Populasi dan Sampel Penelitian 3.3.1. Populasi Penelitian Adalah seluruh pasien tumor ovarium yang datang berobat di Department Obstetri dan Ginekologi RSUP. H. Adam Malik Medan dan RS. Jejaring FK.USU Lainnya dan telah di rencanakanuntuk operasi elektif.

3.3.2. Sampel Penelitian

Sampel penelitian adalah bagian dari populasi yang memenuhi kriteria inklusi dan eklusi yang diambil secara consecutive sampling. Universitas Sumatera Utara 3.4. Kriteria Penelitian 3.4.1. Kriteria Inklusi : • Pasien dengan tumor ovarium yang telah dijadwalkan operasi primer. • Tidak menderita penyakit tumor non ginekologi secara bersamaan. • Bersedia ikut penelitian dan menanda tangani informed consent

3.4.2. Kriteria Eksklusi :

• Pasien yang menderita penyakit tumor ovarium non epithelial dengan atau yang memiliki jenis histopatologi Borderline 3.5.Besar Sampel Besar sampel penelitian dihitung berdasarkan rumus sebagai berikut : 61 n 1 =n 2 = 2 Zα + ZβS X 2 1 - X Dimana : 2 Zα = deviat baku alfa, Nilai α = 0,05Zα= 1,96 Zβ = deviat baku beta, Nilai β = 0,10 1,28 S = simpangan baku gabungan 23,88 S 1 S = simpagan baku kelompok 1 = 8,8 2 = simpangan baku kelompok 2 = 36 Universitas Sumatera Utara S= s 1 2 x n 1 – 1 + s 2 2 x n 2 – n 1 1 + n 2 = 23,88 – 2 x1-x2 = perbedaan rerata kadar yang dianggap bermakna=25 n1=n2= jumlah masing-masing sampel 1 n 1 = n 2 = 2 Zα + Zβ S X 2 1 – X = 19,2~ 19 jumlah sampel masing-masing kasus dan kontrol 2

3.6. Batasan Operasional

1. Tumor Ovarium Definisi : Tumor yang berasal dari ovarium yang ditetapkan dari pemeriksaan klinis dan ultrasonografi USG. Alat ukur : Pemeriksaan histopatologi Cara ukur : pemeriksaan histopatologi jaringan ovarium pasca pembedahan 2. Tumor ovarium epitel Definisi : Tumor ovarium yang dibuktikan berdasarkan pemeriksaan histopatologi yang dilakukan oleh ahli Patologi Anatomi dan tergolong ke dalam tumor ovarium jenis epithel. Dibedakan menjadi: 1. Tumor ovarium epitel ganas : dinyatakan ganas oleh ahli patologi anatomi Universitas Sumatera Utara 2. Tumor ovarium epitel jinak : dinyatakan jinak oleh ahli patologi anatomi. Alat ukur : Pemeriksaan histopatologi Cara ukur : pemeriksaan histopatologi jaringan ovarium pasca pembedahan 3. Pemeriksaan Histopatologi Definisi : Pemeriksaan jaringanmassa tumor secara mikroskopik oleh ahli Patologi Anatomi untuk menentukan ganas atau tidak ganas. Alat ukur : Mikroskop cahaya Cara ukur : pemeriksaan histopatologi 4. CA 125 Definisi : CA 125 adalah serum antigen kankerCA 125 diambil dari spesimen darah vena mediana cubiti volume 5 cc yangdiukur dengan metode immunoassay dalam satuan Uml. Dianggap prediktif terhadap keganasan ovarium jika kadarnya meningkat tiga kali lipat dari nilai normal Nilai normal CA125 = 35 Uml. Alat ukur : pemeriksaan darah Cara ukur : immunoassay Skala ukur : skala nominal N = 35 UmL 5. Angiostatin Universitas Sumatera Utara Definisi : Suatu zat yang terdapat di dalam urin yangditentukan kadarnya dengan tehnik ELISA di laboratorium, yang satuannya di nyatakan dalam ngml nanogram per mililiter. Alat ukur : pemeriksaan urin Cara ukur : Elisa Skala ukur : nominal N :21,4 - 41,5 ngmL 6. Usia Definisi : umur pasien saat operasi sejak tahun lahir, dikelompokkan menjadi 40 tahun dan ≥ 40 tahun Alat ukur : Kalender dalam tahun Cara ukur : anamnesis Skala ukur : skala rasio variable numerik 7. Usia menarche Definisi : usia saat mendapat haid pertama kali, dikelompokkan dalam 10 tahun dan ≥ 10 tahun Alat ukur : Kalender dalam tahun Cara ukur : Anamnesis Skala ukur : Skala rasio variable numerik 8. Menopouse Universitas Sumatera Utara Definisi : Periode tidak mendapat haid selama 12 bulan berturut-turut, dikelompokkan menjadi belum menopause dan sudah menopause. Alat ukur : Kalender dalam tahun Cara ukur : Anamnesis Skala ukur : Skala nominal Variabel kategorik 9. Paritas Definisi : Frekuensi melahirkan dengan usia kandungan diatas 20 minggu, yang dikelompokkan menjadi: -Virgo : belum pernah melakukan kontak seksual - Nullipara : belum pernah melahirkan janin hidup diatas usia 20 minggu kehamilan - paritas ≥ 1: pernah melahirkan janin hidup diatas usia 20 minggu kehamilan sebanyak 1 kali atau lebih Cara ukur : Anamnesis Skala ukur : Skala nominal variable kategorik 3.7. Bahan dan Cara Kerja Bahan untuk penelitian adalah urin yang diambil dari penderita tumor ovarium yang datang berobat ke RSUP H. Adam Malik Medan dan jejaring yang direncanakan operasi elektif dan memenuhi kriteria, serta memberikan persetujuan tertulis. Cara Kerja : Universitas Sumatera Utara 1. Anamnesis, pemeriksaan fisik secara keseluruhan, pemeriksaan laboratorium darah lengkap, kadar gula darah, fungsi hati, fungsi ginjal, elektrolit, hemorrhagic screening test dan USG sebagai alat diagnostik untuk menemtukan ada tidaknya tumor. 2. Setelah dapat ditegakkan diagnosa tumor ovarium Diambil urin pasien dan dimasukkan kedalam tabung. Kemudian urin dikirim ke Laboratorium Prodia Medan untuk pemeriksaan kadar angiostatin dengan metode pemeriksaan ELISA. 3. Prosedur pemeriksaan Angiostatin Urin dengan metode ELISA Reagen: • Angiostatin Microplate Item A:95 wells12 strep x 8 wells aduk dengan antiAngiostatin • Larutan pencuci20 x Item B: 25 ml 20xpengenceran • Standart Item C: 2 vial, recombinan angiostatin • Larutan pengencer Item E : 15 ml 5 kali dikonsentrasikan dengan larutan Buffer. Untuk sampel standar urin yang sudah diencerkan. • Deteksi antibodi Angiostatin Item F: 2 botol biotinylated anti angiostatin setiap vial cukup untuk menguji setengah microple • HRP-Streptavidin Item G: 8µl 40.000x larutan HRP-Streptavidin konjugasi • TMB-One-step substrad reagen Item H: 12 ml 3.3’, 5.5’- tetramethiylbenzidine. • Larutan akhir Item I: 8 ml asam sulfat. 15,16 Universitas Sumatera Utara Prosedur Assay • Siapkan reagen, sampel urin sesuai standar • Tambahkan 100 ul sampel dan larutan standar pada setiap bagian, inkubasikan 2.5 jam pada suhu ruangan, atau pada malam hari pada suhu 4 • Tambahkan 100 ul biotin antibodi yg di siapkan pada setiap bagian, inkubasi 1 jam pada suhu ruangan C • Tambahkan 100 ul larutan sreptavidin yang sudah disiapkan, inkubasikan 30 menit pada suhu ruangan • Tambahkan 100 ul TBM One-step subtrat reagent pada setiap bagian. Inkubasikan 30 menit pada suhu ruangan. • Tambahkan 50 ul stop solution pada setiap bagian. Bacapada 450 nm segera. Persiapan Reagen 15,16 • Semua sampel dan reagen di bawa dalam suhu rungan 18-25 • Contoh pengenceran: jika sampel perlu diencerkan, pengencer Assay item E dapat digunakan untuk pengenceran serumplasmakultur urin. C sebelum digunakan. • Pengencer assay tersebut harus diencerkan 5 kali dengan dideonisasi atau di suling sebelum digunakan. • Persiapan standar: secara singkat gunakan tabung Item C dan kemudian tambahkan 800 µL dengan 1 kali bahan pengencer Item Universitas Sumatera Utara E, Pengencer assay tersebut harus di encerkan 5 kali dengan dideonisasi atau air suling, kedalam tabung item C untuk mempersiapkan larutan standar 2,000 ngmL. Kemudian larutkan bubuk yang dicampurkan secara merata dan berlahan. Masukkan 300 µL kali bahan pengencer kedalam setiap tabung. Dengan menggunakan cairan standart sebanyak 2,000 ngmL cairan untuk menghasilkan beberapa tabung pengencer. Campur setiap tabung secara menyeluruh sebelum dipindahkan ke tabung berikutnya. Campur berlahan-lahan sampai merata. 1 kali pengencer Assay menghasilkan pengenceran menjadi standar nol 0 ngmL. 800 µI Assay 15,16 Diluent 300 µI 300 µI 300 µI 300 µI 300 µI 300 µI 2.000 1.000 500 250 125 62.5 31.250 ngmL ngmL ngmL ngmL ngmL ngmL ngm • Jika saat pencucian dengan 20 kali pencucian masih terlihat kristal, maka hangatkan dalam suhu ruangan dan aduk hingga tercampur dan larut. Larutkan sebanyak 20 ml Wash Buffer ke dalam air suling untuk menghasilkan menghasilkan 400 ml dari 1 x Wash Buffer. Universitas Sumatera Utara • Secara singkat, Putar Detection Antibody vial item F sebelum digunakan. Tambahkan 100 µl setiap 1 x Assay. Larutkan ke dalam tabung untuk mempersiapkan deteksi konsentrasi antibodi. Salurkan keatas dan bawah dengan baik larutan disimpan pada suhu 4 • Putar tabung HRP-Streptavidin Item G sebelum digunakan. Konsentrasi HRP-Streptavidin sebaiknya di encerkan dengan pengenceran 40.000-fold dengan satu kali Assay Diluent. Sebagai contoh: putar sebentar tabung item G dan salurkan ke atas dan bawahuntuk mencampurkan dengan baik. Tambahkan 2 µl larutan HRP-Streptavidin kedalam tabung dengan 198.0 µl 1 kali Assay Diluent untuk mempersiapkan larutan 100fold larutan HRP-Streptavidin jangan simpan larutan encer untuk digunakan pada hari selanjutnya. C selama 5 hari. Untuk mendeteksi konsentrasi antibodi harus diencerkan 80-fold dengan 1 kali Assay Diluentdan digunakan langkah ke empat pada VI Assay procedure. Prosedur Assay 15,16 • Bawa semua reagen dan sampel pada suhu ruangan 18-25 • Tambahkan 100µl sesuai standar kedalam masing-masing tabung lihat persiapan reagen sesuai langkah 2. C sebelum digunakan. Disarankan semua sampel di duplikatkan. • Tutup dan biarkan selama 2.5 jam pada temperatur ruangan atau pada malam hari di suhu 4 C dengan pengadukan yang Universitas Sumatera Utara berlahan.Menyingkirkan endapan dan dibilas 4 kali dengan 1 kali pencucian endapan. Pencucian dengan mengisi masing-masing bahan pencuci 300 µl dengan menggunakan pipet multi kanal atau alat pencuci otomatis. Cairan penghapus lengkap pada setiap langkah sangat penting untuk hasil yang baik. Setelah pencucian terakhir, menghapus sisa larutan pencuci dengan aspirasi atau penyedotan. Bersihkan cawan dan alat penghapus dengan handuk bersih. • Tambahkan 100 µl pada setiap satu kali persiapan biotinylated antibodi persiapan reagen langkah 6 pada masing-masing dengan baik. Inkubasi selama 45 menit dalam suhu ruangan dengan pengadukan berlahan. • Buang endapan, ulangi pencucian seperti pada langkah 3. • Tambahkan 100 µl untuk persiapan endapan Streptavidin lihat persiapan langkah 7 masing-masing dengan baik. Inkubasi selama 45 menit pada suhu ruangan dengan adukan pelan. • Buang endapan. Ulangi pencucian seperti langkah 3. • Tambahkan 100 µl dari TMB setiap langkah substrat reagen Item H pada masing-masing reagen dengan baik. Inkubasi selama 30 menit dalam suhu ruangan pada kamar gelap dengan di aduk secara perlahan. • Tambahkan 50 larutan akhir Item I dengan baik. Prosedur Assay • Siapkan semua reagen, sampel sesuai standar. Universitas Sumatera Utara • Tambahkan 100 µl masing-masing sampel. Inkubasi selama 2.5 jam pada temperatur ruangan atau lebih 4 • Tambahkan 100 µl untuk persiapan biotin antibodidengan baik. Inkubasi 1 jam pada suhu ruangan. C pada malam hari. • Tambahkan 100 µl larutan Streptavidin. Inkubasi 45 menit dalam suhu ruangan. • Tambahkan 100 µl TMB langkah pertama subtrat reagen pada masing-masing dengan baik. Inkubasi 30 menit dalam suhu ruangan. • Tambahkan 50 µl larutan akhir pada masing-masing dengan baik sampai 450 nm. 15,16 Penghitungan Hasil Hitung absorbansi rata-rata setiap set duplikat standar, kontrol dan sampel, dan kurangi endapan sampai rata-rata nol dengan standar optik. Alur kurva standar pada log-log grafik paper atau dengan menggunakan software plot sigma, dengan standar konsentrasi pada sumbu X dan absorsi pada sumbu Y. Gambarkan garis lurus terbaik pada titik-titik standar. 4. Pasca Laparatomi, dilakukan pemeriksaan Histopatologi spesimen hasil operasi oleh ahli Patologi Anatomi di Departemen Patologi Anatomi RSUP H.Adam Malik Medan. Universitas Sumatera Utara

3.8. Pengolahan dan Analisi Data 1.