3.3.3.1. Pemisahan Tanin
Ekstrak pekat metanol yang sudah menarik semua senyawa polar dan non polar dari bunga mawar putih dilarutkan dengan pelarut etil asetat untuk memisahkan
tanin. Tanin juga merupakan senyawa polifenol yang tidak larut dalam pelarut polar aprotik, misalnya; etil asetat. Kemudian lapisan etil asetat disaring dan
dipekatkan dengan rotarievaporator.
3.3.3.2. Ekstraksi Partisi dengan N-Heksana
Ekstrak etil asetat dilarutkan dengan metanol kembali yang bertujuan untuk ekstraksi partisi dengan N-heksana. Pada Ekstraksi partisi pelarut harus tidak
bercampur agar terbentuk 2 lapisan. Digunakan pelarut N-heksana bertujuan untuk menghilangkan senyawa non polar, misalnya; klorofil, lemak, zat lilin dll.
3.3.3.3. Hidrolisa
Ekstrak pekat metanol dihidrolisa HCl 6 dengan bertujuan untuk memutuskan ikatan gula pada senyawa flavonoida dengan perbandingan sampel dan HCl 6
adalah 2:5 lalu dipanaskan diatas waterbath selama 30 menit lalu disaring untuk memperoleh filtrat yang bebas gula. Mabry et all, 1970
3.3.3.4. Ekstraksi Partisi dengan Kloroform
Filtrat yang sudah bebas gula diekstraksi partisi dengan kloroform. Digunakan kloroform karena metanol yang sudah bercampur dengan air yang berasal dari
HCl 6 tidak bercampur dengan kloroform. Sehingga lapisan yang kita butuhkan adalah lapisan kloroform.
3.3.3.5. Pemisahan Komponen-Komponen dengan Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom bertujuan untuk mempekat fraksi-fraksikan ekstrak pekat kloroform menjadi fraksi-fraksi yang lebih murni. Kromatografi kolom dilakukan
dengan menggunakan fasa diam silika gel 60F
254
Merck dan fasa gerak n- heksana:etil asetat 90:10; 80:20; 70:30; 60:40; vv. Pada alat kromatografi
kolom diisi dengan silika gel yang telah dibuburkan dengan n-heksana. Ekstrak pekat kloroformflavonoid total dimasukkan kedalam kolom. Kemudian dielusi
dengan menggunakan n-heksana:etil asetat 90:10; 80:20; 70:30; 60:40; vv. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setial 10 ml, lalu di KLT dan
digabung fraksi dengan harga Rf yang sama lalu diuji dengan FeCl
3
5. Kemudian diuapkan hingga terbentuk kristal. Kristal yang diperoleh diuji dengan
KLT untuk melihat apakah sudah murni yakni adanya satu noda dan jika terdapat noda dua atau lebih maka dimurnikan dengan KLT Preparatif dan rekristalisasi.
3.3.4. Analisis Kromatografi Lapis Tipis