5. Kloroforom
Teknis 6.
Benzena Teknis 7.
Aseton Teknis 8.
Silika gel 60 G 0.063-0.200 mm E.Merck. KGaA
9. FeCl
3
5 10.
NaOH 10 11.
Serbuk Mg 12.
HCl
p
13. H
2
SO
4P
14. HCl 6
15. Plat KLT
Merck Kieselgel 60F
254
16. Pereaksi Benedict
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1. Penyediaan Sampel
Pada penelitian, sampel yang diteliti adalah bunga mawar putih yang diperoleh dari Kecamatan Medan Johor, Medan, Sumatera Utara. Bunga mawar putih segar
yang diteliti dalam penelitian ini sebanyak 900 gram.
3.3.2.Skrining Fitokimia
Untuk mengetahui adanya senyawa flavonoida yang terdapat dalam bunga mawar putih maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif dengan reaksi warna
sebagai berikut; 10 gram serbuk bunga mawar putih yang telah dikeringkan ke dalam dua gelas Erlenmeyer lalu ditambahkan 100 mL metanol ke dalam gelas
Erlenmeyer I, dan 100 mL etil asetat ke dalam gelas Erlenmeyer II. Didiamkan selama 1 malam. Didekantasi lalu dibagi masing-masing ekstrak sampel ke dalam
4 tabung reaksi
- Untuk ekstrak metanol dan etil asetat
a. Tabung I : dengan FeCl
3
5 menghasilkan larutan berwarna hitam b. Tabung II : dengan serbuk Mg, dan HCl
p
menghasilkan larutan merah jambu c. Tabung III: dengan NaOH 10 menghasilkan larutan biru kehijauan
d. Tabung IV: dengan H
2
SO
4p
menghasilkan larutan orange kekuningan
Pada analisis kromatografi lapis tipis dimaksudkan untuk menguji hasil isolasi yang sudah murni. Apabila pada KLT terdapat satu nodabercak maka
isolat sudah murni.
3.3.3. Ekstraksi dan Fraksinasi
Bunga mawar putih ditimbang segar sebanyak 900 g, lalu dimaserasi dengan metanol sebanyak 10 L sampai semua sampel terendam. Sampel direndam 24 jam.
Maserat ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga ekstrak pekat metanol didapatkan.
3.3.3.1. Pemisahan Tanin
Ekstrak pekat metanol yang sudah menarik semua senyawa polar dan non polar dari bunga mawar putih dilarutkan dengan pelarut etil asetat untuk memisahkan
tanin. Tanin juga merupakan senyawa polifenol yang tidak larut dalam pelarut polar aprotik, misalnya; etil asetat. Kemudian lapisan etil asetat disaring dan
dipekatkan dengan rotarievaporator.
3.3.3.2. Ekstraksi Partisi dengan N-Heksana
Ekstrak etil asetat dilarutkan dengan metanol kembali yang bertujuan untuk ekstraksi partisi dengan N-heksana. Pada Ekstraksi partisi pelarut harus tidak
bercampur agar terbentuk 2 lapisan. Digunakan pelarut N-heksana bertujuan untuk menghilangkan senyawa non polar, misalnya; klorofil, lemak, zat lilin dll.
3.3.3.3. Hidrolisa
Ekstrak pekat metanol dihidrolisa HCl 6 dengan bertujuan untuk memutuskan ikatan gula pada senyawa flavonoida dengan perbandingan sampel dan HCl 6
adalah 2:5 lalu dipanaskan diatas waterbath selama 30 menit lalu disaring untuk memperoleh filtrat yang bebas gula. Mabry et all, 1970
3.3.3.4. Ekstraksi Partisi dengan Kloroform
Filtrat yang sudah bebas gula diekstraksi partisi dengan kloroform. Digunakan kloroform karena metanol yang sudah bercampur dengan air yang berasal dari
HCl 6 tidak bercampur dengan kloroform. Sehingga lapisan yang kita butuhkan adalah lapisan kloroform.
3.3.3.5. Pemisahan Komponen-Komponen dengan Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom bertujuan untuk mempekat fraksi-fraksikan ekstrak pekat kloroform menjadi fraksi-fraksi yang lebih murni. Kromatografi kolom dilakukan
dengan menggunakan fasa diam silika gel 60F
254
Merck dan fasa gerak n- heksana:etil asetat 90:10; 80:20; 70:30; 60:40; vv. Pada alat kromatografi
kolom diisi dengan silika gel yang telah dibuburkan dengan n-heksana. Ekstrak pekat kloroformflavonoid total dimasukkan kedalam kolom. Kemudian dielusi
dengan menggunakan n-heksana:etil asetat 90:10; 80:20; 70:30; 60:40; vv. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setial 10 ml, lalu di KLT dan
digabung fraksi dengan harga Rf yang sama lalu diuji dengan FeCl
3
5. Kemudian diuapkan hingga terbentuk kristal. Kristal yang diperoleh diuji dengan
KLT untuk melihat apakah sudah murni yakni adanya satu noda dan jika terdapat noda dua atau lebih maka dimurnikan dengan KLT Preparatif dan rekristalisasi.
3.3.4. Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak pekat kloroform dengan menggunakan fasa diam silika gel 60F
254
Merck. Pada analisis ini
dimaksudkan untuk mengetahui sistem dan rasio pelarut yang sesuai untuk pemisahan yang baik pada kromatografi kolom.
Dimasukkan 10 ml larutan fase gerak n-heksana : etil asetat 90:10 vv ke dalam chamber kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat kloroform pada
plat KLT lalu dimasukkan pada chamber yang telah jenuh, ditutup, dan dielusi. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana lalu dikeringkan. Kemudian, plat
dilihat di bawah lampu UV, lalu diamati nodanya yang tampak. Dihitung harga Rf yang didapatkan. Perlakuan yang sama dilakukan juga pada perbandingan pelarut
n-heksana : etil asetat 80:20; 70:30; 60:40; vv.
3.3.5. Pemurnian dan Pemurnian Hasil Isolasi
