dimaksudkan untuk mengetahui sistem dan rasio pelarut yang sesuai untuk pemisahan yang baik pada kromatografi kolom.
Dimasukkan 10 ml larutan fase gerak n-heksana : etil asetat 90:10 vv ke dalam chamber kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat kloroform pada
plat KLT lalu dimasukkan pada chamber yang telah jenuh, ditutup, dan dielusi. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana lalu dikeringkan. Kemudian, plat
dilihat di bawah lampu UV, lalu diamati nodanya yang tampak. Dihitung harga Rf yang didapatkan. Perlakuan yang sama dilakukan juga pada perbandingan pelarut
n-heksana : etil asetat 80:20; 70:30; 60:40; vv.
3.3.5. Pemurnian dan Pemurnian Hasil Isolasi
3.3.5.1 Pemurnian Hasil Isolasi Dengan KLT Preparatif
Senyawa hasil isolasi dari kromatografi yang belum murni tersebuth dilarutkan ditotolkan secara merata disepanjang tepi bawah plat KLT yang berukuran
20x20cm yang telah dibuat batas bawah dan atas yakni 2cm. Plat dimasukkan kedalam chamber yang diisi dengan pelarut. Lalu dijenuhkan, dan ditutup setelah
dielusi plat dikeluarkan dari chamber. Plat KLT preparatif tersebuth dikeringkan dan hasilnya diperiksa dibawah sinar UV. Akan terbentuk beberapa zona maka,
zona yang memiliki harga Rf mendekati 0,5 akan dikeruk, dilarutkan dengan etil asetat lalu disaring.
3.3.5.2 Rekristalisasi
Kristal hasil isolasi dilarutkan dengan etil asetat dan n-heksana. Pada rekristalisasi digunakan dua pelarut yang saling bercampur. Dimana satu pelarut dapat
melarutkan kristal sedangkan pelarut lain tidak dapat melarutkan kristal sehingga terjadi pengendapan senyawa yang tidak larut didasar wadah. Etil asetat dapat
melarutkan senyawa isolat sedangkan n-heksana tidak dapat melarutkan senyawa hasil isolat. Larutan yang bagian atas dipipet sehingga kristal yang tidak larut
tertinggal didasar wadah.
3.3.5.3. Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis
Uji kemurnian kristal yang dilakukan dengan KLT yakni dengan fasa diam silika gel 60 F
254
dengan fasa gerak n-heksana : etil asetat 70:30 vv.. Dimasukkan 10 ml fasa gerak dalam chamber lalu dijenuhkan. Ditotolkan kristal pada batas
bawah, teknik penotolan kristal yang baik yakni harus bulat dan sekecil mungkin. Setelah fasa gerak merembes sampai batas atas, maka plat KLT dikeluarkan dari
chamber, dikeringkan, lalu dilihat dibawah sinar UV.
3.3.5.4. Uji Kemurnian Hasil Isolasi Dengan Penentuan Titik Lebur
Kristal hasil isolasi yang telah murni dimasukkan ke dalam alat melting point apparatus lalu diamati pada suhu berapa kristal melebur. Dalam prosedur
penelitian ini dilakukan uji titik lebur dilakukan karena hasil yang diperoleh berupa kristal.
3.3.6. Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi
