BAB 3
METODE PENELITIAN
3.1 Alat-alat
1. Spektrofotometer FT-IR
Shimadzu 2.
Spektrofotometer UV-Visible Shimadzu
3. Spektrometer
1
H-NMR JeolDelta2NMR500MHz
4. Ekstraktor
Schoot Duran 5.
Pipa kapiler 6.
Rotarievaporator Bűchi R-114
7. Labu rotarievaporator
8. Labu didih
Schoot Duran 9.
Kolom kromatografi Pyrex
10. Lampu UV
UVGL 58 11.
Alat destilasi 12.
Bejana Kromatografi Lapis Tipis
3.2 Bahan-bahan
1. Bunga mawar putih segar
2. Metanol Destilasai
3. N-heksana
Teknis 4.
Etil asetat Teknis
5. Kloroforom
Teknis 6.
Benzena Teknis 7.
Aseton Teknis 8.
Silika gel 60 G 0.063-0.200 mm E.Merck. KGaA
9. FeCl
3
5 10.
NaOH 10 11.
Serbuk Mg 12.
HCl
p
13. H
2
SO
4P
14. HCl 6
15. Plat KLT
Merck Kieselgel 60F
254
16. Pereaksi Benedict
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1. Penyediaan Sampel
Pada penelitian, sampel yang diteliti adalah bunga mawar putih yang diperoleh dari Kecamatan Medan Johor, Medan, Sumatera Utara. Bunga mawar putih segar
yang diteliti dalam penelitian ini sebanyak 900 gram.
3.3.2.Skrining Fitokimia
Untuk mengetahui adanya senyawa flavonoida yang terdapat dalam bunga mawar putih maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif dengan reaksi warna
sebagai berikut; 10 gram serbuk bunga mawar putih yang telah dikeringkan ke dalam dua gelas Erlenmeyer lalu ditambahkan 100 mL metanol ke dalam gelas
Erlenmeyer I, dan 100 mL etil asetat ke dalam gelas Erlenmeyer II. Didiamkan selama 1 malam. Didekantasi lalu dibagi masing-masing ekstrak sampel ke dalam
4 tabung reaksi
- Untuk ekstrak metanol dan etil asetat
a. Tabung I : dengan FeCl
3
5 menghasilkan larutan berwarna hitam b. Tabung II : dengan serbuk Mg, dan HCl
p
menghasilkan larutan merah jambu c. Tabung III: dengan NaOH 10 menghasilkan larutan biru kehijauan
d. Tabung IV: dengan H
2
SO
4p
menghasilkan larutan orange kekuningan
Pada analisis kromatografi lapis tipis dimaksudkan untuk menguji hasil isolasi yang sudah murni. Apabila pada KLT terdapat satu nodabercak maka
isolat sudah murni.
3.3.3. Ekstraksi dan Fraksinasi
Bunga mawar putih ditimbang segar sebanyak 900 g, lalu dimaserasi dengan metanol sebanyak 10 L sampai semua sampel terendam. Sampel direndam 24 jam.
Maserat ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga ekstrak pekat metanol didapatkan.
3.3.3.1. Pemisahan Tanin
Ekstrak pekat metanol yang sudah menarik semua senyawa polar dan non polar dari bunga mawar putih dilarutkan dengan pelarut etil asetat untuk memisahkan
tanin. Tanin juga merupakan senyawa polifenol yang tidak larut dalam pelarut polar aprotik, misalnya; etil asetat. Kemudian lapisan etil asetat disaring dan
dipekatkan dengan rotarievaporator.
3.3.3.2. Ekstraksi Partisi dengan N-Heksana
Ekstrak etil asetat dilarutkan dengan metanol kembali yang bertujuan untuk ekstraksi partisi dengan N-heksana. Pada Ekstraksi partisi pelarut harus tidak
bercampur agar terbentuk 2 lapisan. Digunakan pelarut N-heksana bertujuan untuk menghilangkan senyawa non polar, misalnya; klorofil, lemak, zat lilin dll.
3.3.3.3. Hidrolisa
Ekstrak pekat metanol dihidrolisa HCl 6 dengan bertujuan untuk memutuskan ikatan gula pada senyawa flavonoida dengan perbandingan sampel dan HCl 6
adalah 2:5 lalu dipanaskan diatas waterbath selama 30 menit lalu disaring untuk memperoleh filtrat yang bebas gula. Mabry et all, 1970
3.3.3.4. Ekstraksi Partisi dengan Kloroform
Filtrat yang sudah bebas gula diekstraksi partisi dengan kloroform. Digunakan kloroform karena metanol yang sudah bercampur dengan air yang berasal dari
HCl 6 tidak bercampur dengan kloroform. Sehingga lapisan yang kita butuhkan adalah lapisan kloroform.
3.3.3.5. Pemisahan Komponen-Komponen dengan Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom bertujuan untuk mempekat fraksi-fraksikan ekstrak pekat kloroform menjadi fraksi-fraksi yang lebih murni. Kromatografi kolom dilakukan
dengan menggunakan fasa diam silika gel 60F
254
Merck dan fasa gerak n- heksana:etil asetat 90:10; 80:20; 70:30; 60:40; vv. Pada alat kromatografi
kolom diisi dengan silika gel yang telah dibuburkan dengan n-heksana. Ekstrak pekat kloroformflavonoid total dimasukkan kedalam kolom. Kemudian dielusi
dengan menggunakan n-heksana:etil asetat 90:10; 80:20; 70:30; 60:40; vv. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setial 10 ml, lalu di KLT dan
digabung fraksi dengan harga Rf yang sama lalu diuji dengan FeCl
3
5. Kemudian diuapkan hingga terbentuk kristal. Kristal yang diperoleh diuji dengan
KLT untuk melihat apakah sudah murni yakni adanya satu noda dan jika terdapat noda dua atau lebih maka dimurnikan dengan KLT Preparatif dan rekristalisasi.
3.3.4. Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak pekat kloroform dengan menggunakan fasa diam silika gel 60F
254
Merck. Pada analisis ini
dimaksudkan untuk mengetahui sistem dan rasio pelarut yang sesuai untuk pemisahan yang baik pada kromatografi kolom.
Dimasukkan 10 ml larutan fase gerak n-heksana : etil asetat 90:10 vv ke dalam chamber kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat kloroform pada
plat KLT lalu dimasukkan pada chamber yang telah jenuh, ditutup, dan dielusi. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana lalu dikeringkan. Kemudian, plat
dilihat di bawah lampu UV, lalu diamati nodanya yang tampak. Dihitung harga Rf yang didapatkan. Perlakuan yang sama dilakukan juga pada perbandingan pelarut
n-heksana : etil asetat 80:20; 70:30; 60:40; vv.
3.3.5. Pemurnian dan Pemurnian Hasil Isolasi
3.3.5.1 Pemurnian Hasil Isolasi Dengan KLT Preparatif
Senyawa hasil isolasi dari kromatografi yang belum murni tersebuth dilarutkan ditotolkan secara merata disepanjang tepi bawah plat KLT yang berukuran
20x20cm yang telah dibuat batas bawah dan atas yakni 2cm. Plat dimasukkan kedalam chamber yang diisi dengan pelarut. Lalu dijenuhkan, dan ditutup setelah
dielusi plat dikeluarkan dari chamber. Plat KLT preparatif tersebuth dikeringkan dan hasilnya diperiksa dibawah sinar UV. Akan terbentuk beberapa zona maka,
zona yang memiliki harga Rf mendekati 0,5 akan dikeruk, dilarutkan dengan etil asetat lalu disaring.
3.3.5.2 Rekristalisasi
Kristal hasil isolasi dilarutkan dengan etil asetat dan n-heksana. Pada rekristalisasi digunakan dua pelarut yang saling bercampur. Dimana satu pelarut dapat
melarutkan kristal sedangkan pelarut lain tidak dapat melarutkan kristal sehingga terjadi pengendapan senyawa yang tidak larut didasar wadah. Etil asetat dapat
melarutkan senyawa isolat sedangkan n-heksana tidak dapat melarutkan senyawa hasil isolat. Larutan yang bagian atas dipipet sehingga kristal yang tidak larut
tertinggal didasar wadah.
3.3.5.3. Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis
Uji kemurnian kristal yang dilakukan dengan KLT yakni dengan fasa diam silika gel 60 F
254
dengan fasa gerak n-heksana : etil asetat 70:30 vv.. Dimasukkan 10 ml fasa gerak dalam chamber lalu dijenuhkan. Ditotolkan kristal pada batas
bawah, teknik penotolan kristal yang baik yakni harus bulat dan sekecil mungkin. Setelah fasa gerak merembes sampai batas atas, maka plat KLT dikeluarkan dari
chamber, dikeringkan, lalu dilihat dibawah sinar UV.
3.3.5.4. Uji Kemurnian Hasil Isolasi Dengan Penentuan Titik Lebur
Kristal hasil isolasi yang telah murni dimasukkan ke dalam alat melting point apparatus lalu diamati pada suhu berapa kristal melebur. Dalam prosedur
penelitian ini dilakukan uji titik lebur dilakukan karena hasil yang diperoleh berupa kristal.
3.3.6. Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi
3.3.6.1. Identifikasi dengan Spektrofotometer Ultraviolet-Visible UV-Vis
Analisis dengan alat Spektrofotometer Ultraviolet-Visible UV-Vis diperoleh dari Laboratorium Penelitian Kimia Organik, USU dengan menggunakan metanol
sebagai pelarut.
3.3.6.2. Identifikasi dengan Spektrofotometer Infra Merah FT-IR
Analisis dengan alat Spektrofotometer Infra Merah FT-IR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong,
Tangerang dengan menggunakan KBr pellet.
3.3.6.3. Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton
1
H-NMR
Analisis dengan alat Spektrometer
1
H-NMR diperoleh dari Pusat Penelitian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong, Tangerang dengan menggunakan Aseton
sebagai pelarut.
3.4. Bagan Skrining Fitokimia
3.4.1. Bagan Skrining Fitokimia dengan Metanol
di maserasi dengan metanol disaring
dibagi ke dalam 4 tabung reaksi
Tabung I Tabung II
Tabung III Tabung
IV ditambahkan
pereaksi FeCl
3
5 diamati
perubahan warna
ditambahkan pereaksi
NaOH 10 diamati
perubahan warna
ditambahkan pereaksi Mg-
HCl diamati
perubahan warna
ditambahkan pereaksi
H
2
SO
4P
diamati perubahan
warna
Larutan Hitam Positif
Flavonoida Larutan Biru
kehijauan Positif
Flavonoida Larutan
merah muda Positif
Flavonoida Larutan orange
kekuningan Positif
Flavonoida 10 gram Bunga mawar putih
segar
3.4.1. Bagan Skrining Fitokimia dengan Etil Asetat
di maserasi dengan etil asetat disaring
dibagi ke dalam 4 tabung reaksi
Tabung I Tabung II
Tabung III Tabung
IV ditambahkan
pereaksi FeCl
3
5 diamati
perubahan warna
ditambahkan pereaksi
NaOH 10 diamati
perubahan warna
ditambahkan pereaksi Mg-
HCl diamati
perubahan warna
ditambahkan pereaksi
H
2
SO
4P
diamati perubahan
warna
Larutan Hitam Positif
Flavonoida Larutan Biru
kehijauan Positif
Flavonoida Larutan
merah muda Positif
Flavonoida Larutan orange
kekuningan Positif
Flavonoida 10 gram Bunga mawar putih
segar
3.5 Bagan Penelitian
900 gram Bunga mawar putih segar
Dimaserasi dengan Metanol
Ampas Ekstrak Metanol
Dipekatkan dengan rotarievaporator Didiamkan selama 1 hari
Diulangi sebanyak 3 kali
Diuapkan pelarut metanol sampai habis diatas waterbath
Ekstrak pekat metanol Dilarutkan dengan etil asetat
berulang-ulang sampai bening Disaring
Ekstrak etil asetat
Dirotari evaporator Diuapkan pelarut etil asetat
sampai habis di atas waterbath Endapan
Ekstrak pekat etil asetat
Lapisan Metanol Dilarutkan dengan metanol
Diekstraksi partisi dengan n-heksana sampai bening Lapisan n-heksana
Dipekatkan dengan rotari evaporator Dihidrolisa dengan HCl 2N sambildipanaskan selama 1 jam
Disaring Larutan Metanol asam
Diekstraksi partisi dengan kloroform Lapisan kloroform
Dipekatkan dengan rotari evaporator Diuapkan hingga kloroform habis
Residu
Ekstrak pekat kloroform flavonoid total
Diskrining fitokimia
Lanjutan
Diskrining fitokimia Diuji KLT untuk mengetahui eluen yang sesuai pada kromatografi kolom
Dikolom kromatografi dengan fasa diam silika gel 60GF 0,063-0,2mm dan fasa gerak ialah n-heksan : etil asetat dengan perbandingan 90:10;80:20;70:30;60:40vv
Diuji KLT untuk mengetahui harga Rf Digabung Fraksi dengan harga Rf yang sama
Fraksi 1-31fraksi eluen
n-heksana: etil asetat
90:10vv Fraksi 32-58
fraksi eluen n-heksana: etil
asetat 80:20vv
Fraksi 59-72 fraksi eluen
n-heksana: etil asetat 70:30vv
Fraksi 73-115 fraksi eluen
n-heksana: etil asetat 60:40vv
DiKLT denganeluen n-heksana: etilasetat
7:3vv Dilihat dibawah
sinar UV Ditest dengan FeCl
3
Terdapat 3 noda, + pada FeCl
3
dan terdapat adsorpsi UV
DiKLT Preparatif dengan fase diam silika gel dan fase gerak
n-heksana: etil asetat 7:3vv
Direkristalisasi Dianalisis KLT
Dihitung massanya Diuji titik leburnya
Dianalisa dengan spektrofotometer UV-Visible, FT-IR,
1
H-NMR Hasil Analisa
Hasil negatif
Hasil negatif
Hasil positif
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil Penelitian
Kategori