Ekstrak ditotolkan pada plat lapis tipis, kemudian dimasukan ke dalam chamber yang telah jenuh dengan uap fase gerak. Setelah pengembangan selesai
plat dikeluarkan dan dikeringkan, plat disemprot dengan penampak bercak Liebermann-Burchard dan dipanaskan di oven pada suhu 105°C selama 15 menit
lalu diamati warna yang terbentuk. Kromatogram ekstrak dapat dilihat pada lampiran 9 halaman 55.
3.9 Fraksinasi ekstrak n-heksan dengan KCV
Ekstrak n-heksan difraksinasi secara KCV menggunakan pelarut landaian n-heksan - etilasetat dengan perbandingan 100:0, 90:10, 80:20, 70:30,
60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80, 10:90, 0:100. Cara kerja:
Sebagai kolom digunakan corong Buchner kaca masir, lalu dimasukkan silika gel 60 H yang dikemas dalam keadaan kering ke dalam corong. Alat vakum
dihidupkan untuk memperoleh kerapatan yang maksimum. Kemudian cuplikan yang telah dicampur dengan silika gel 60 H dimasukkan pada bagian atas kolom
yang disebar secara merata, lalu di atasnya diletakkan kertas saring. Alat vakum dihidupkan kembali. Sampel dielusi dengan pelarut mulai dari kepolaran rendah
lalu kepolaran ditingkatkan perlahan-lahan dan kolom dihisap sampai kering pada setiap pengumpulan fraksi Hostettmann, 1986. Bagan isolasi steroida dari
ekstrak n-heksan herba suruhan dapat dilihat pada lampiran 10 halaman 56.
3.10 Analisis KLT hasil KCV
Hasil fraksinasi yang telah dipekatkan tersebut di KLT menggunakan fase diam plat pra lapis, pengembang n-heksan - etilasetat 90:10 dengan penampak
bercak Liebermann-Burchard. Diperoleh 11 fraksi dan pola kromatogram yang
Universitas Sumatera Utara
sama digabungkan. Kromatogram KLT dari fraksi-fraksi hasil KCV dapat dilihat pada lampiran 11 dan 12 halaman 57-58.
3.11 Isolasi senyawa steroida hasil fraksinasi secara KLT preparatif
Terhadap fraksi A2 yang mengandung bercak berwarna ungu dan merah ungu dilakukan isolasi secara KLT preparatif. Sebagai penyemprot digunakan
pereaksi penyemprot Liebermann-Burchard dan sebagai fase gerak digunakan n- heksan - etilasetat 90:10 dan fase diam silika gel GF
254
. Cara kerja:
Fraksi ditotolkan pada jarak 2 cm dari tepi bawah plat KLT berukuran 20x20 cm yag telah diaktifkan sehingga membentuk pita. Setelah kering plat KLT
dimasukkan kedalam bejana yang telah jenuh dengan uap fase gerak, pengembang dibiarkan naik membawa komponen yang ada. Setelah mencapai batas
pengembangan plat dikeluarkan dari bejana lalu dikeringkan. Bagian tengah plat ditutup dengan kaca yang bersih sedangkan pada sisi kanan dan kiri plat
disemprot dengan pereaksi penyemprot Liebermann-Burchard dan dipanaskan dengan alat pengering. Bagian tengah plat yang sejajar dengan bercak berwarna
ungu dan merah ungu dikerok dan dikumpulkan, direndam dengan metanol satu malam lalu disaring kemudian pelarutnya diuapkan. Kemudian dilakukan uji
kemurnian dengan KLT terhadap isolat yang diperoleh. Kromatogram dapat dilihat pada lampiran 13 halaman 59.
3.12 Uji kemurnian kristal hasil isolat
