masing pelarut, sehingga dengan demikian akan diperoleh sistem pengembang yang cocok. Pelarut pengembang yang digunakan dalam kromatografi lapis tipis
antara lain: n-heksana, karbontetraklorida, benzena, kloroform, eter, etil asetat, piridian, aseton, etanol, metanol dan air Gritter dkk., 1991; Sudjadi, 1988.
c. Harga Rf
Untuk menggambarkan jarak pengembangan senyawa pada kromatogram dipakai istilah harga Rf Stahl, 1985.
Jarak titik pusat bercak dari titik awal Rf =
Jarak garis depan pelarut dari titik awal Harga Rf beragam mulai dari 0 sampai 1. Faktor-faktor yang mempengaruhi harga
Rf Sastrohamidjojo, 1985: a.
Struktur kimia dari senyawa yang dipisahkan b.
Sifat penyerap c.
Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap d.
Pelarut dan derajat kemurniannya e.
Derajat kejenuhan uap pengembang dalam bejana f.
Teknik percobaan g.
Jumlah cuplikan yang digunakan h.
Temperatur i.
Kesetimbangan
2.4.2 Kromatografi Cair Vakum
Cara ini pertama kali dipublikasikan oleh Coll dkk. Pada tahun 1977 dengan mengguanakan corong Buchner kaca masir atau kolom pendek untuk
Universitas Sumatera Utara
mengisolasi diterpena sembrenoid dari terumbu karang Australia. Kolom kromatografi dikemas kering dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan
kemasan maksimum. Vakum dihentikan, pelarut yang kepolarannya rendah dituangkan ke permukaan penjerap lalu divakumkan lagi. Kolom dihisap sampai
kering dan sekarang siap dipakai. Sampel, dilarutkan dalam pelarut yang cocok, dimasukkan langsung pada
bagian atas kolom atau pada lapisan pra penyerap dan dihisap perlahan-lahan kedalam kemasan dengan memvakumkannya. Kolom, dielusi dengan campuran
pelarut yang cocok, mulai dari pelarut yang kepolarannya rendah lalu kepolarannya ditingkatkan perlahan-lahan, kolom dihisap sampai kering pada
setiap pengumpulan fraksi. Oleh karena itu kromatografi cair vakum menggunakan tekanan rendah untuk meningkatkan laju aliran fase gerak
Hostettmann, 1995.
2.4.3 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
Salah satu metode pemisahan yang memerlukan biaya paling murah dan memakai peralatan sedarhana ialah KLT preparatif. Walaupun KLT preparatif
dapat memisahkan dalam jumlah gram, sebagian besar pemakaian hanya dalam jumlah miligram. KLT preparatif dilakukan dengan menggunakan lapisan tebal
sampai 1 mm sebagai pengganti lapisan penyerap yang tipis 0,10-0,25 mm. pita-pita sampel yang sudah dipisah dapat diperoleh kembali dengan cara
mengerok penyerap dari plat KLT preparatif yang telah dikembangkan. Demikian kuatnya lapisan penyerap melekat pada kaca penyokong sehingga memungkinkan
pengembangan plat berulang-ulang dengan pengembang yang sama atau
Universitas Sumatera Utara
pengembang yang berbeda, dengan terlebih dulu mngeringkan plat sebelum pengembangan berikutnya Harborne, 1987.
Fase diam yang paling sering dugunakan biasanya dengan ketebalan 0,5-2 mm dan ukuran plat kromatogram biasanya 20x20 cm. fase diam yang paling
umum dipakai ialah silika gel dan dipakai untuk pemisahan berbagai campuran senyawa lipofil maupun senyawa hidrofil.
Sampel dilarutkan dalam sedikit pelarut sebelum ditotolkan pada plat KLT preparatif. Pelarut yang baik ialah pelarut yang mudah menguap atsiri, karena
jika pelarut kurang atsiri terjadi pelebaran pita. Konsentrasi sampel harus sekitar 5-10. Sampel ditotolkan berupa pita yang harus ditotolkan sesempit mungkin
karena pemisahan tergantung pada lebar pita. Pemilihan pelarut ditentukan berdasarkan pemeriksaan pendahuluan memakai KLT analitik. Karena ukuran
partikel penyerap kira-kira sama, pelarut yang dipakai pada KLT analitik dapat dipakai pada KLT preparatif.
Pengembangan plat KLT preparatif biasanya dilakukan dalam bejana kaca yang dapat menampung beberapa plat. Bejana dijaga tetap jenuh dengan pelarut
pengembang dengan bantuan sehelai kertas saring yang tecelup ke dalam larutan pengembang. Keefisienan pemisahan dapat ditingkatkan dengan cara
pengembangan berulang. Harus diperhatikan bahwa semakin lama senyawa berkontak dengan penyerap maka semakin besar kemungkinan penguraian
Hostettmann, 1995.
2.5 Spektrofotometri
