3.9 Pemeriksaan Skrining Fitokimia Ekstrak Etanol Daun Bangun-
Bangun EEDBB
Prosedur pemeriksaan golongan senyawa kimia ekstrak etanol daun bangun-bangun dilakukan sama seperti prosedur untuk pemeriksaan skrining
fitokimia serbuk simplisia. Hasil pemeriksaan dapat dilihat pada Tabel 4.4, halaman 50.
3.10 Uji Efek Antikarsinogenesis
Uji efek antikarsinogenesis meliputi penyiapan hewan percobaan, penyiapan sediaan uji yang meliputi penyiapan CMC 1, suspensi ekstrak
daun- daun, larutan benzoαpiren, larutan buffer formalin 10 pH 6-7.
3.10.1 Penyiapan hewan percobaan
Hewan yang digunakan adalah mencit betina dengan berat 20-30 g dibagi menjadi 5 kelompok, 1 kelompok normal, 1 kelompok kontrol negatif,
dan 3 kelompok uji. Tiap kelompok terdiri dari 5 ekor mencit. Sebelum digunakan sebagai hewan percobaan, semua mencit dipelihara
selama kurang lebih satu minggu untuk penyesuaian dengan lingkungannya, mengontrol kesehatan dan berat badan serta menyeragamkan makanannya.
3.10.2 Penyiapan sediaan uji
Penyiapan sediaan uji meliputi penyiapan CMC 1, penyiapan suspensi ekstrak daun bangun-bangun, penyiapan larutan penginduksi
benzoαpiren, dan penyiapan larutan buffer netral formalin 10.
3.10.2.1 Penyiapan CMC 1 Pembuatan suspensi CMC 1 bv dilakukan dengan cara
Universitas Sumatera Utara
sebagai berikut: sebanyak 250 mg CMC ditaburkan ke dalam lumpang yang berisi air suling panas sebanyak 8 ml. Didiamkan selama 15 menit hingga
diperoleh massa yang transparan, digerus hingga berbentuk gel dan diencerkan dengan sedikit air, kemudian dituang ke dalam labu tentukur 25 ml, ditambah
air suling sampai batas tanda.
3.10.2.2 Penyiapan larutan benzoαpiren 15 mgkg bb
Penyiapan larutan penginduksi benzoαpiren 15 mgkg bb dilakukan dengan cara sebagai berikut: Sebanyak 100 mg benzoαpiren dilarutkan dalam
100 ml minyak zaitun dan dipastikan semua benzoαpiren sudah larut.
3.10.2.3 Penyiapan suspensi ekstrak etanol daun bangun-bangun SEEDBB
Suspensi ekstrak etanol daun bangun bangun dibuat menjadi 3 dosis yaitu, 250 mgkg bb, 500 mgkg bb dan 750 mgkg bb. Pembuatan suspensi
ekstrak daun bangun-bangun dosis 250 mgkg bb dilakukan dengan cara sebagai berikut: sebanyak 250 mg CMC ditaburkan ke dalam lumpang yang
berisi air suling panas sebanyak 8 ml. Didiamkan selama 15 menit hingga diperoleh masa yang transparan, digerus hingga berbentuk gel. Ditambahkan
sebanyak 625 mg ekstrak etanol daun bangun-bangun ke dalam lumpang, kemudian digerus sampai homogen. Dituang ke dalam labu tentukur 25 ml,
ditambah air suling hingga batas tanda. Dengan cara yang sama dilakukan untuk dosis 500 mgkg bb dan 750 mgkg bb.
3.10.2.4 Penyiapan larutan formalin 10
Sebanyak 4 gram Natrium dihidrogen phospat dilarutkan dalam air suling kemusian ditambahkan 6,5 gram dinatrium dihidrogen phospat diaduk
Universitas Sumatera Utara
hingga larut. Ditambahkan 100 ml formalin 37 dan ditambahkan air suling
hingga 1000 ml. Cek pH menggunakan pH meter pH 6-7. 3.10.2.5 Uji Antikarsinogenesis
Hewan percobaan dikelompokkan menjadi 5 kelompok, masing-masing terdiri dari 5 ekor hewan percobaan. Kelompok tersebut adalah:
- Kelompok I: Kontrol normal, hewan percobaan diberikan makanan
standar selama 7 hari berturut-turut dan tidak diinduksi dengan benzoαpiren dan tidak diberikan ekstrak uji. Selama 28 hari berat
badan mencit ditimbang satu per satu. -
Kelompok II: Kontrol negatif, hewan percobaan diberikan makanan standar selama 7 hari berturut-turut kemudian pada hari ke 8 diberikan
benzoαpiren dosis 15 mgkg bb secara sub kutan selama 14 hari tanpa diberikan ekstrak uji. Selama 28 hari diamati perkembangan tumor
yang terjadi, perubahan berat badan mencit, dan dicatat apabila ada mencit yang mati. Pada hari ke 29, mencit dibunuh dan dibedah untuk
diambil jaringan tumor payudara yang terbentuk. -
Kelompok III: Kelompok perlakuan, hewan uji diberikan makanan standar
dan diinduksi dengan benzoαpiren dosis 15 mgkg secara sub kutan selama 14 hari berturut-turut kemudian pada hari ke 15 diberikan
EEDBB dosis 250 mgKg bb secara per oral, selama 14 hari berturut- turut. Selama 28 hari diamati perkembangan tumor yang terjadi,
perubahan berat badan mencit, dan dicatat apabila ada mencit yang mati. Pada hari ke 29, mencit dibunuh dan dibedah untuk diambil
jaringan tumor payudara yang terbentuk.
Universitas Sumatera Utara
- Kelompok IV: Kelompok perlakuan, hewan uji diberikan makanan
standar dan diinduksi dengan benzoαpiren dosis 15 mgkg secara sub
kutan selama 14 hari berturut-turut kemudian pada hari ke 15 diberikan EEDBB dosis 500 mgKg bb secara per oral, selama 14 hari berturut-
turut. Selama 28 hari diamati perkembangan tumor yang terjadi, perubahan berat badan mencit, dan dicatat apabila ada mencit yang
mati. Pada hari ke 29, mencit dibunuh dan dibedah untuk diambil jaringan tumor payudara yang terbentuk.
- Kelompok V: Kelompok perlakuan, hewan uji diberikan makanan
standar dan diinduks i dengan benzoαpiren dosis 15 mgkg secara sub
kutan, selama 14 hari berturut-turut kemudian pada hari ke 15 diberikan EEDBB dosis 750 mgKg bb secara per oral, selama 14 hari berturut-
turut. Selama 28 hari diamati perkembangan tumor yang terjadi, perubahan berat badan mencit, dan dicatat apabila ada mencit yang
mati. Pada hari ke 29, mencit dibunuh dan dibedah untuk diambil jaringan tumor payudara yang terbentuk.
3.10.2.6 Pengambilan jaringan
Mencit dibunuh dengan cara cervical dislocation dislokasi leher lalu mencit diposisikan pada papan bedah menggunakan pins. Bulu mencit dicukur
mulai dari daerah perut kemudian sisa bulu dibersihkan dengan menggunakan kapas yang dibasahi air. Bedah dimulai dari bagian perut menggunakan
gunting bengkok, kemudian diambil dan dipisahkan masing-masing organ menggunakan gunting lurus bagian yang diambil ± 5-10 mm sekitar tumor
mammae. Organ yang diambil dibersihkan dari lemak-lemak yang menempel,
Universitas Sumatera Utara
kemudian dicuci dengan menggunakan larutan NaCl 0,9 setelah itu diamati secara makroskopik nodul yang tampak. Organ ditiriskan diatas kertas saring,
setelah air berkurang masing-masing organ dimasukkan ke dalam pot berisi larutan buffer netral formalin 10.
3.10.2.7 Pemeriksaan gambaran jaringan kelenjar payudara dengan pewarnaan hematoxylin dan eosin
Pemeriksaan histopatologi organ mencit dengan pembuatan preparat histopatologi dengan pewarnaan Haematoxyllin-Eosin. Proses pembuatan
preparat histopatologi dan pewarnaan Haematoxyllin-Eosin : 1.
Penyiapan jaringan tumor payudara untuk dipotong Jaringan yang akan dibuat sediaan histopatologi difiksasi dalam larutan
Buffer Netral Formalin BNF 10 minimal 48 jam hingga mengeras matang. Sampel organ yang terfiksasi dengan sempurna ditrimming setebal ±
0,5 cm. Potongan kemudian dimasukkan dalam tissue cassette untuk dimasukkan dalam automatic tissue processor.
2. Dehidrasi
Proses dehidrasi dimaksudkan untuk menarik air dari jaringan dan mencegah terjadinya pengerutan sampel yang akan diuji. Dehidrasi dilakukan
dengan cara merendam sampel dalam larutan alkohol dengan konsentrasi bertingkat 70, 80, 90, 95, dan alkohol absolut. Proses perendaman
masing-masing konsentrasi alkohol dilakukan selama 2 jam. Proses dehidrasi dilakukan dengan menggunakan mesin otomatis yaitu automatic tissue
processor.
Universitas Sumatera Utara
3. Clearing
Proses clearing atau penjernihan dilakukan dengan 2 tahap dengan menggunakan xylol I dan xylol II. Penggunaan xylol dimaksudkan untuk
melarutkan alkohol. 4.
Infiltrasi Infiltrasi dan impregnasi adalah proses pengisian parafin kedalam pori-
pori jaringan. Pengisian pori-pori ini dimaksudkan untuk mengeraskan jaringan agar mudah dipotong dengan pisau mikrotom. Parafin yang digunakan adalah
parafin histoplast
®
. 5.
Embedding dan Blocking Embedding atau blocking adalah proses penanaman jaringan dalam
blok parafin. Parafin yang digunakan parafin histoplast. Proses embedding dilakukan dengan menggunakan alat tissue embedding console.
6. Sectioning
Sectioning adalah proses pemotongan jaringan dengan menggunakan mikrotom dengan ketebalan 2-3 µm. Pemotongan dilakukan dengan alat rotary
microtom. Dimasukkan ke dalam waterbath, agar parafin mencair dari dalam organ yang telah dipotong, kemudian organ diambil menggunakan object glass
dan disimpan dalam inkubator dengan suhu 37
o
C selama 24 jam. 7.
Pewarnaan Haematoxyllin-Eosin Sebelum melakukan pewarnaan, preparat histopatologi dideparafinisasi
dengan larutan xylol I dan II selama 2 menit. Kemudian dilakukan proses rehidrasi dengan cara mencelupkan sediaan ke dalam alkohol bertingkat
alkohol absolut, alkohol 95, alkohol 90, alkohol 80. Perendaman dalam
Universitas Sumatera Utara
alkohol 95 dan 80 dilakukan selama 1 menit. Kemudian sediaan dicuci dengan air yang mengalir air kran selama 1 menit. Sediaan diwarnai dengan
pewarna Mayer’s Haematoxyllin dengan tahapan sebagai berikut: a. Preparat direndam dalam larutan Mayer’s Haematoxyllin selama 8
menit. b. dicuci dengan air mengalir air kran selama 30 detik.
c. dicelupkan ke dalam larutan Lithium Carbonat selama 15-30 detik. d. dicuci dengan air mengalir air kran selama 2 menit.
e. direndam dalam larutan Eosin selama 2-3 menit. f.
dicuci dengan air mengalir air kran selama 30-60 detik. g. dilakukan proses rehidrasi dan clearing dengan cara preparat
dicelupkan ke dalam larutan alkohol 95 dan alkohol absolut sebanyak 10 kali celupan, absolut I selama 2 menit, xylol I selama 1 menit dan
xylol II selama 2 menit. 8.
Setelah pewarnaan, sediaan ditetesi perekat Canada balsem Entellan
®
dan ditutup dengan cover glass. 9.
Diamati dengan menggunakan mikroskop cahaya.
3.11 Analisis Data
Kategori