COI untuk mengamati keragaman genetik populasi P. maxima Indonesia dan Australia.
2.2.2 Metode Analisis PCR – RFLP
Prosedur awal dalam analisis mtDNA adalah memecah sel untuk mengesktrak mtDNA. Tahap berikutnya adalah amplifikasi yaitu proses
perbanyakan sintesis sekuen mtDNA. Amplifikasi dapat dilakukan secara in vitro dengan menggunakan teknik PCR Polymerase Chain Reaction atau in vivo
melalui teknik kloning pada sel hidup. Jaringan contoh yang digunakan dapat berupa hati, otot, darah, sel kultur atau jaringan lain, baik dalam kondisi segar,
telah difiksasi ataupun beku Erlich 1989. Pada prinsipnya teknik PCR adalah proses enzimatis untuk memperbanyak
DNA dengan memanfaatkan sifat replikasi DNA dan perubahan fisik DNA terhadap suhu. Proses ini dibantu dengan enzim Taq-DNA polymerase pada tahap
ekstensi polinukleotida primer Zyskind dan Bernstein 1993. Replikasi terjadi jika terdapat untai tunggal DNA yang bertindak sebagai cetakan template dan
basa nukleotida dNTP. Enzim DNA polimerase membantu dalam pembentukan DNA untai lainnya. Primer adalah potongan pendek DNA terdiri dari 20–30
nukleotida yang melakukan hibridisasi pita secara berpasangan dengan sekuen tertentu yang mengapit flanking daerah DNA target amplifikasi pada tiap pita
DNA Erlich 1989. Pada kondisi normal, DNA berada dalam keadaan heliks ganda. Heliks ini
terdiri atas dua utas tunggal DNA yang saling berpasangan dan terikat non- kovalen oleh ikatan hidrogen. Pada awal proses PCR, utas ganda ini didenaturasi
pada suhu tinggi hingga menjadi utas tunggal. Selanjutnya, suhu diturunkan untuk memungkinkan primer utas tunggal menempel pada daerah target. DNA
polimerase kemudian digunakan untuk pemanjangan sekuen dengan bantuan suplai empat basa nukleotida dNTP; Adenin, Guanin, Timin, dan Sitosin dan
buffer. Dengan cara ini dapat menghasilkan duplikat daerah target dan siklus ini biasanya berlangsung 20–40 kali Erlich 1989.
Kelebihan teknik PCR adalah proses isolasi cepat, jumlah sekuen DNA yang dihasilkan dapat mencapai 300.000 kopi, sangat sensitif dalam mendeteksi sekuen
DNA target dari sampel dan tidak memerlukan enzim lain selama siklus. Selain
itu, suhu tinggi dalam sintesa DNA 75 °C dapat meningkatkan ketelitian
sehingga meminimumkan ekstensi primer yang tidak sesuai dengan template Zyskind dan Bernstein 1993. Dalam prosedur PCR ini, struktur sekunder dari
template DNA yang dapat menghalangi aktivitas enzim polimerase juga akan direduksi melalui denaturasi sekuen pada suhu tinggi, namun demikian beberapa
faktor harus diperhatikan supaya pita-pita yang dihasilkan baik dan utuh, antara lain konsentrasi DNA, ukuran dan komposisi basa primer dan suhu hibridisasi
Erlich 1989. Metode RFLP merupakan suatu cara yang digunakan untuk mengetahui
perbedaan profil ukuran fragmen DNA dari individu yang berbeda, dengan menggunakan enzim restriksi untuk memotong sekuen mtDNA teramplifikasi.
Hansen et al. 1997 menyatakan bahwa teknik RFLP menggunakan suatu enzim restriksi endonuklease yang dapat memotong fragmen besar DNA pada situs
restriksi tertentu menjadi fragmen yang lebih kecil. Visualisasi hasil pemotongan dapat menunjukkan pola fragmen yang khas tergantung jenis DNA dan enzim
yang digunakan. Organisme yang berbeda memiliki perbedaan urutan DNA, sehingga teknik RFLP dapat membedakan jenis organisme pada tingkat spesies
atau strain dan telah banyak digunakan diantaranya pada moluska. Kombinasi antara teknik PCR dan penggunaan enzim retriksi atau teknik sekuensing
nukleotida dapat menggambarkan karakter atau profil DNA individual yang berguna untuk menjelaskan hubungan filogenetik populasional dalam takson.
2.3 Parameter Kualitas Air yang Berhubungan dengan Kelangsungan Hidup Tiram Mutiara
Kategori