hasil PCR, gel loading buffer dan penanda DNA. Gel agarose dibuat dengan cara memanaskannya di atas hotplate dan diaduk
rata. Setelah gel larut dan berwarna bening, larutan tersebut dibiarkan sampai hangat, kemudian teteskan etidium bromida sebanyak 0,1 ml; kemudian
dituangkan ke dalam cetakan yang telah terpasang sisir pembuat lubang dengan ketebalan 3–5 mm, selanjutnya gel dibiarkan sampai membeku dan dimasukkan
ke dalam bak elektroforesis yang berisi buffer elektroforesis. Contoh dan marker DNA masing-masing dicampur dengan gel loading
buffer lalu dimasukkan dalam lubang-lubang yang terdapat pada gel dengan menggunakan mikropipet. Setelah running selama 5 jam atau migrasi sepanjang ¾
bagian dari panjang gel, kemudian keberadaan DNA dilihat dengan ultraviolet illuminator.
Digesti mtDNA dengan enzim retriksi Digesti mtDNA dilakukan menggunakan enzim restriksi. Tahapannya adalah
mencampur 15,5 µl dH
2
O; 2,0 µl DNA hasil amplifikasi PCR, buffer enzim 2,0
µl, enzim restriksi 0,5 µl sehingga total larutan 20 µl dalam tabung Eppendorf steril dan dilakukan on ice karena enzim sangat sensitif terhadap suhu dan mudah
rusak kemudian campuran dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 1–4 jam, selanjutnya elektroforesis untuk mengetahui hasil digesti enzim dan
untuk pengamatan jumlah dan ukuran fragmen restriksi bend menggunakan ultraviolet illuminator
3.3 Analisis Keragaman Genetik mtDNA
Fragmen hasil restriksi mtDNA teramplifikasi dapat ditera berdasarkan marker. Setiap pola fragmen terdiri dari satu atau lebih fragmen DNA hasil digesti
sebagai genotipe individu dari setiap enzim restriksi. Genotipe individual dari suatu enzim dicirikan dengan kode huruf letter code, dan kombinasi genotipe
dari enzim restriksi tersebut merupakan tipe haplotipe dari setiap individu tiram. Keragaman genetik intrapopulasi diukur berdasarkan parameter ‘diversitas
haplotipe’ h. Diversitas haplotipe h dihitung menurut persamaan Nei 1987:
Keterangan: n: ∑ contoh, X
i
: frekuensi haplotipe sampai ke-i dari suatu populasi
1 1
2
∑ −
− =
i
x n
n h
Perbedaan genetik interpopulasi diukur berdasarkan parameter jarak genetik genetic distance Nei 1987 yang dianalisis dengan menggunakan program
TFPGA dan hubungan filogenetik interpopulasi digambarkan dalam bentuk dendrogram berdasarkan analisis kluster terhadap nilai jarak genetik menurut
metode jarak rata-rata UPGMA Bermingham 1990 dalam program TFPGA.
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil
Lima puluh contoh tiram mutiara P. margaritifera yang dianalisis berasal dari lima lokasi yaitu di Sumbawa SB, Bali Utara BA, Selat Sunda SS,
Belitung BL, dan Sulawesi Selatan SL.
4.1.1 Amplifikasi mtDNA pada Daerah Cytochrome Oxidase I COI
Amplifikasi daerah COI mtDNA pada tiram mutiara P. margaritifera menggunakan primer universal COI menghasilkan fragmen DNA berukuran
sekitar 750 pb pada semua populasi contoh tiram mutiara yaitu populasi Sumbawa, Bali Utara, Selat Sunda, Belitung, dan Sulawesi Selatan. Fragmen yang
teramplifikasi didigesti dengan enzim restriksi. Fragmen mtDNA teramplifikasi dengan primer universal COI disajikan pada Gambar 5.
Gambar 5. Fragmen mtDNA teramplifikasi dengan primer universal COI
Ket: M: marker, pb: pasangan basa, SB: Sumbawa, BA: Bali Utara, SS: Selat Sunda, BL: Belitung, SL: Sulawesi Selatan
4.1.2 Pola Restriksi Fragmen mtDNA Teramplifikasi
Pada penelitian ini telah dicoba 16 enzim restriksi Lampiran 4, namun hanya tiga enzim yang memberikan hasil digesti polimorfik yaitu FokI, HaeIII,
NlaIV, dua enzim menghasilkan digesti yang monomorfik yaitu DpnII dan Eco0190I, dan 11 enzim lainnya tidak terjadi digesti. Keragaman jumlah situs dan
ukuran fragmen restriksi RFLP yang diperoleh dari hasil digesti mtDNA dengan lima enzim adalah 13 tipe restriksi genotipe yaitu FokI dengan empat tipe
restriksi A, B, C, D, HaeIII dengan tiga tipe restriksi A, B, C, NlaIV dengan empat tipe restriksi A, B, C, D, sedangkan DpnII dan Eco0190I menghasilkan
