III. BAHAN DAN METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Lokasi Pengambilan Contoh
Penelitian dilakukan dengan metode survei pengambilan contoh dan pengamatan di laboratorium. Pengambilan contoh dilakukan dari bulan Mei–
Desember 2007 dan analisis laboratorium dilaksanakan dari bulan Februari–Juni 2008. Tiram mutiara contoh dikoleksi dari lima lokasi yang mewakili sebaran
tiram mutiara P. margaritifera di Indonesia, yaitu Sumbawa, Bali Utara, Selat Sunda, Belitung, dan Sulawesi Selatan. Peta pengambilan contoh dapat dilihat
pada Lampiran 3.
3.2 Metode 3.2.1 Metode Pengambilan Contoh
Pengambilan contoh tiram mutiara dilakukan dengan penyelaman ke dasar perairan atau dari tempat budidaya tiram setempat. Contoh tiram dari Sumbawa
berasal dari perairan Pulau Panjang, Selat Alas, tiram mutiara Bali Utara berasal dari Teluk Pegametan, Bali, tiram mutiara Selat Sunda berasal dari perairan Pulau
Handeuleum, Selat Sunda, tiram mutiara Belitung berasal dari perairan Selat Ru, sedangkan tiram mutiara Sulawesi Selatan berasal dari Teluk Awerange, Barru.
Jumlah contoh tiram mutiara adalah 10 ekor untuk masing-masing lokasi dengan ukuran sekitar 10–30 cm. Contoh tiram mutiara yang dikoleksi disimpan dalam
larutan alkohol 70 −100 untuk keperluan analisis DNA di laboratorium. Analisis
DNA contoh tiram mutiara dilakukan di Laboratorium Rekayasa Genetik Loka Pemuliaan dan Teknologi Budidaya Air Tawar, Sukamandi.
Data sekunder mengenai sifat fisik dan kimia perairan lokasi sampling yang mempengaruhi kelangsungan hidup dan distribusi tiram mutiara, meliputi
kedalaman, suhu, salinitas, oksigen terlarut, dan produksi primer, dikumpulkan dari berbagai literatur.
3.2.2 Analisis DNA mitokondria
Ekstraksi DNA Ekstrak DNA yaitu melakukan tahapan penghancuran sel, eliminasi protein
dan RNA, serta pengendapan protein. Tahap penghancuran sel yaitu
menghaluskan potongan daging sebanyak 20 mgcontoh dengan scapel kemudian dimasukkan ke dalam tabung 1,5 ml yang telah diisi 250
µl larutan sel lisis yang terdiri 10
µl Tris pH 8; 100 mM EDTA pH 8; 2 SDS, lalu ditambahkan 5 µl protein kinase dan inkubasi pada suhu 55
o
C selama 4–24 jam. Tahap berikutnya adalah tahap eliminasi protein dan RNA yaitu dengan menambahkan 250
µl amonium asetat ke dalam larutan kemudian dihomogenkan aduk kencang selama
lima menit hingga tercampur rata. Diaduk perlahan selama 15 menit pada suhu ruang, selanjutnya dimasukkan dalam suhu 4
o
C selama 10 menit. Tahap selanjutnya adalah tahap pengendapan protein dengan sentrifugasi pada kecepatan
13.000 rpm selama 10 menit. Larutan supernatant lapisan cair dipindahkan ke dalam tabung baru dan ditambahkan etanol 100 sebanyak dua kali volume
supernatant, lalu disentrifugasi kembali pada kecepatan 13.000 rpm selama 5 menit kemudian etanol dibuang, lalu ditambahkan alkohol 70 sebanyak 600
µl dan disentrifugasi pada kecepatan 13.000 selama 3 menit. Lapisan etanol dibuang
dan dikeringanginkan selama 30 menit, ditambahkan 50 µl buffer T10E0.1 dan
inkubasi pada suhu 65
o
C selama 1 jam Nguyen et al. 2006. Amplifikasi mtDNA dengan PCR
mtDNA diamplifikasikan menggunakan primer universal Cytochrome Oxidase I COI forward: 5’-ATA ATG ATA GGA GGR TTT GG-3’ dan
reverse: 5’-GCT CGT GTR CTA CRT CCA T-3’ Williams dan Benzie 1997. Amplifikasi dilakukan menggunakan metode polymerase Chain Reaction PCR
dengan komposisi premiks yaitu dH
2
O 13,6 µl, 10 x Buffer 5 µl; 25 mM MgCl
2
1,5 µl; 2,5 mM dNTP 0,5 µl; 10 pM primer masing-masing 1,6 µl; 5 unitµl Taq-
DNA polymerase 0,2 µl; genom DNA sebanyak 1 µl, sehingga volume akhir tiap
mikrotube adalah 25 µl. Tube yang berisi contoh dimasukkan ke dalam mesin
PCR yang telah diprogram menurut Benzie et al. 2003 yaitu proses denaturasi pada suhu 94
°C selama 1 menit, annealing pada suhu 45 °C selama 1 menit, dan extension pada suhu 72
°C selama 1 menit, sebanyak 30 siklus. Hasil PCR dapat langsung dianalisis dengan elektroforesis atau disimpan di dalam refrigerator.
Bahan-bahan yang digunakan dalam proses elektroforesis dengan agarose 3 yaitu bubuk agarose sebanyak 0,9 g, tris borate TBE 30 ml, contoh DNA
hasil PCR, gel loading buffer dan penanda DNA. Gel agarose dibuat dengan cara memanaskannya di atas hotplate dan diaduk
rata. Setelah gel larut dan berwarna bening, larutan tersebut dibiarkan sampai hangat, kemudian teteskan etidium bromida sebanyak 0,1 ml; kemudian
dituangkan ke dalam cetakan yang telah terpasang sisir pembuat lubang dengan ketebalan 3–5 mm, selanjutnya gel dibiarkan sampai membeku dan dimasukkan
ke dalam bak elektroforesis yang berisi buffer elektroforesis. Contoh dan marker DNA masing-masing dicampur dengan gel loading
buffer lalu dimasukkan dalam lubang-lubang yang terdapat pada gel dengan menggunakan mikropipet. Setelah running selama 5 jam atau migrasi sepanjang ¾
bagian dari panjang gel, kemudian keberadaan DNA dilihat dengan ultraviolet illuminator.
Digesti mtDNA dengan enzim retriksi Digesti mtDNA dilakukan menggunakan enzim restriksi. Tahapannya adalah
mencampur 15,5 µl dH
2
O; 2,0 µl DNA hasil amplifikasi PCR, buffer enzim 2,0
µl, enzim restriksi 0,5 µl sehingga total larutan 20 µl dalam tabung Eppendorf steril dan dilakukan on ice karena enzim sangat sensitif terhadap suhu dan mudah
rusak kemudian campuran dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 1–4 jam, selanjutnya elektroforesis untuk mengetahui hasil digesti enzim dan
untuk pengamatan jumlah dan ukuran fragmen restriksi bend menggunakan ultraviolet illuminator
3.3 Analisis Keragaman Genetik mtDNA
Kategori