Analisis asam lemak AOAC 1984
membandingkan waktu retensinya dengan standar pada kondisi analisis yang sama. Waktu retensi dihitung pada kertas rekorder sebagai jarak dari garis pada
saat muncul puncak pelarut sampai ke tengah puncak komponen yang dipertimbangkan.
Gambar 7 Prosedur analisis asam amino menggunakan HPLC.
Tambelo kering 0,75 g
Penambahan 5-10 ml HCl 6N Pemanasan dalam oven pada
suhu 100
o
C selama 24 jam Hidrolisat Protein
Penyaringan dengan milipore berukuran 45 mikron
Filtrat hidrolisat Penambahan 30 μL larutan pengering
campuran antara metanol, natrium asetat, dan trietilamim dengan perbandingan 2:2:1
Pengeringan dengan gas N
2
Hidrolisat protein kering Penambahan 30 μL larutan derivatisasi
campuran antara metanol, pikoiotisianat, dan trietilamin dengan perbandingan 3:3:4
Pengenceran dengan buffer asetat sebanyak 200 μL lalu dibiarkan selama 20 menit
Penyaringan dengan milipore berukuran 0,45 mikron
Injeksi ke alat HPLC Kromatogram
a. Preparasi contohd hidrolisis dan esterifikasi Contoh lemak ditimbang sebanyak 20-30 mg, kemudia ditambahkan 1 mL
larutan NaOH 0,5 N ke dalam metanol dan dipanaskan dalam penangas air selama 20 menit. Sebanyak 2 mL BF
3
16 dan 5 mgmL standar internal ditambahkan pada sampel tersebut, lalu dipanaskan lagi selama 20 menit dan selanjutnya
didinginkan. Sampel kemudian ditambahkan 2 mL NaCl jenuh dan 1 mL n-heksana, lalu dikocok dengan baik. Lapisan heksana dipindahkan dengan
bantuan pipet tetes ke dalam tabung yang berisi 0,1 gram Na
2
SO
4
anhidrat, dibiarkan 15 menit. Fasa cair dipisahkan dan selanjutnya diinjeksikan ke
kromatografi gas. b. Analisis komponen asam lemak dengan kromatografi gas
Pelarut sebanyak 1 µL diinjeksikan ke dalam kolom. Bila aliran gas pembawa dan sistem pemanasan sempurna, puncak pelarut akan nampak dalam
kurang dari 1 menit. Sebanyak 5 µL campuran standar FAME diinjeksikan setelah pena kembali ke nol baseline. Jika semua puncak sudah keluar,
diinjeksikan 5 µL sampel yang telah dipreparasi A. Waktu retensi dan puncak masing-masing komponen tersebut kemudian diukur. Jika rekorder dilengkapi
dengan integrator, waktu retensi dan luas puncak langsung diperoleh dari integrator dan membandingkan waktu retensinya dengan standar untuk
mendapatkan informasi mengenai jenis dari komponen-komponen dalam contoh. Jumlah dari masing-masing komponen dalam sampel dihitung menggunakan
metode internal standar, dengan cara sebagai berikut :
Keterangan :
C
x
= kosentrasi komponen x C
s
= kosentrasi standar internal A
x
= luas puncak komponen x A
s
= luas puncak standar internal R
= respon detektor terhadap komponen x relatif terhadap standar
Kondisi alat kromatografi gas pada saat dilakukan analisis : 1. Kolom
: cyanopropil methylsil kolom kapiler 2. Dimensi kolom
: p=60m,ø dalam = 0.25 mm, 025 µm film tickness 3. Laju alir n
2
: 20 mlmenit 4. Laju alir h
2
: 30 mlmenit 5. Laju alir udara
: 200 – 250 mlmenit
6. Suhu injektor : 200
o
c 7. Suhu detektor
: 230
o
c 8. Suhu kolom
: program temperatur - Kolom temperatur : awal 190
o
C diam 15 menit akhir 230
o
C diam 20 menit 9. Ratio
: 1 : 8 10. Injeksi volum
: 1 µl 11. Linier velocity
: 20 cm.sec