Uji fitokimia Departemen Kesehatan RI 1995

3.3.2.3 Uji aktivitas antioksidan Yeh dan Cen 1995

Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan dengan menggunakan metode perendaman radikal bebas DPPH 1,1-diphenyl-2-picrlhylhydrazyl Yeh dan Cen 1995. Prinsip kerjanya pada sampel mengandung senyawa bersifat antioksidan yang dapat meredam radikal bebas DPPH. Uji ini dilakukan terhadap e kstrak tambelo. Ekstrak dilarutkan dalam metanol dan dibuat dalam berbagai konsentrasi 20, 40, 60, dan 80 ppm, kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Ekstrak tersebut masing-masing ditambahkan 200 μl larutan DPPH 1mM dalam metanol. Volume dicukupkan sampai 5 mL, kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit. Serapan sampel tersebut diukur pada panjang gelombang 515 nm. Butylated hydroxytoluene BHT dan vitamin super ester C digunakan sebagai kontrol positif, dan untuk pembanding dengan masing-masing kosentrasi 4, 6, 8, dan 10 ppm. Hambatan dihitung dengan rumus. Nilai absorbansi sampel diperoleh persentase penghambatan aktivitas radikal bebas. Persamaan regresi diperoleh dari hubungan antara kosentrasi sampel dan persentase penghambatan aktivitas radikal bebas. Nilai kosentrasi dan hambatan ekstrak diplotkan masing-masing pada sumbu x dan y. Persamaan regresi yang diperoleh dalam bentuk y = bx + a. Persamaan ini digunakan untuk mencari Inhibition Concentration 50 IC 50 dengan memasukkan angka 50 sebagai y sehingga didapatkan nilai x sebagai IC 50 . Pengujian ini dilakukan sebanyak tiga kali ulangan.

3.3.2.4 Fraksinasi senyawa antioksidan

Fraksinasi terhadap ekstrak kasar tambelo dilakukan pada ekstrak yang memiliki aktivitas antioksidan tertinggi ekstrak terpilih. Metode yang digunakan ada dua macam, yaitu kromatografi lapis tipis KLT dan kromatografi kolom KK. a Kromatografi lapis tipis KLT Pada penelitian ini, pemilihan pelarut untuk fraksinasi dilakukan dengan mencoba beberapa kombinasi untuk mengembangkan spot ekstrak terpilih pada kromatografi lapis tipis KLT. Kombinasi yang digunakan adalah pelarut kloroform:metanol dengan perbandingan 9:1 mL, pelarut heksan : etil asetat dengan perbandingan 1:1 mL dan pelarut kloroform : metanol dengan perbandingan 17:3 mL, pelarut heksan:etil asetat dengan perbandingan 8:2 dan n-heksana:kloroform 3:2, untuk memilih eluen terbaik dicoba dengan berbagai eluen n-heksana, kloroform, etil asetat, dan metanol. Ekstrak terpilih sebanyak 0,02 gram dilarutkan dalam 0,5 mL pelarutnya. Larutan ekstrak tersebut kemudian ditotolkan pada plat silika gel 60 F254 dengan panjang l0 cm. Kombinasi pelarut yang menghasilkan pengembangan spot terbaik digunakan sebagai eluen untuk memfraksinasi ekstrak terpilih dengan kromatografi lapis tipis maupun kromatografi kolom. Diagram alir fraksinasi dengan metode KLT dapat disajikan pada Gambar 9. Gambar 9 Diagram alir fraksinasi dengan metode KLT. b Kromatografi kolom KK Gritter et al. l99l Pelaksanaan kromatografi kolom dilakukan dengan memasang kolom pada statif secara tegak lurus. Kolom diberi glasswool pada bagian bawahnya. Diagram alir fraksinasi dengan metode kromatografi kolom dapat dilihat pada Gambar 10. Pencucian kolom dilakukan dan pembuatan larutan silika gel silika gel G40-63 yang akan dimasukkan ke dalam kolom sebelum ekstrak dimasukkan ke dalam kolom. Silika gel sebanyak 13-15 gram dilarutkan pada eluenn kloroform : metanol = 9:1 sehingga diperoleh larutan silika gel. Semua larutan silika gel masuk ke dalam kolom, lalu dilakukan penjenuhan silika gel dalam kolom selama 30-60 menit. Pada proses penjenuhan, bagian atas kolom ditutup Ekstrak aktif CHCl 3 :MeOH 9:1ml CHCl 3 :MeOH 17:3 ml terbentuknya spot terbanyak Heksan:EtOH 1:1ml Heksan:EtOH 8:2ml Heksan :CHCl 3 3:2 ml KLT silika gel