Uji aktivitas antioksidan Yeh dan Cen 1995 Fraksinasi senyawa antioksidan

kromatografi lapis tipis KLT. Kombinasi yang digunakan adalah pelarut kloroform:metanol dengan perbandingan 9:1 mL, pelarut heksan : etil asetat dengan perbandingan 1:1 mL dan pelarut kloroform : metanol dengan perbandingan 17:3 mL, pelarut heksan:etil asetat dengan perbandingan 8:2 dan n-heksana:kloroform 3:2, untuk memilih eluen terbaik dicoba dengan berbagai eluen n-heksana, kloroform, etil asetat, dan metanol. Ekstrak terpilih sebanyak 0,02 gram dilarutkan dalam 0,5 mL pelarutnya. Larutan ekstrak tersebut kemudian ditotolkan pada plat silika gel 60 F254 dengan panjang l0 cm. Kombinasi pelarut yang menghasilkan pengembangan spot terbaik digunakan sebagai eluen untuk memfraksinasi ekstrak terpilih dengan kromatografi lapis tipis maupun kromatografi kolom. Diagram alir fraksinasi dengan metode KLT dapat disajikan pada Gambar 9. Gambar 9 Diagram alir fraksinasi dengan metode KLT. b Kromatografi kolom KK Gritter et al. l99l Pelaksanaan kromatografi kolom dilakukan dengan memasang kolom pada statif secara tegak lurus. Kolom diberi glasswool pada bagian bawahnya. Diagram alir fraksinasi dengan metode kromatografi kolom dapat dilihat pada Gambar 10. Pencucian kolom dilakukan dan pembuatan larutan silika gel silika gel G40-63 yang akan dimasukkan ke dalam kolom sebelum ekstrak dimasukkan ke dalam kolom. Silika gel sebanyak 13-15 gram dilarutkan pada eluenn kloroform : metanol = 9:1 sehingga diperoleh larutan silika gel. Semua larutan silika gel masuk ke dalam kolom, lalu dilakukan penjenuhan silika gel dalam kolom selama 30-60 menit. Pada proses penjenuhan, bagian atas kolom ditutup Ekstrak aktif CHCl 3 :MeOH 9:1ml CHCl 3 :MeOH 17:3 ml terbentuknya spot terbanyak Heksan:EtOH 1:1ml Heksan:EtOH 8:2ml Heksan :CHCl 3 3:2 ml KLT silika gel dengan aluminium foil untuk mencegah penguapan eluen yang terdapat dalam kolom sehingga silika gel tetap dalam kondisi basah. Ekstrak yang akan difraksinasi adalah ekstrak terpilih sebesar 1 gram dan dilarutkan pada pelarut asal sebanyak 3 mL. Silika gel harus jenuh sebelum ekstrak dimasukkan dan setelah silika gel jenuh maka kran kolom dibagian bawah kolom dibuka kembali setelah semua ekstrak masuk ke dalam kolom. Ekstrak dibiarkan mengalir ke bagian penjerap kolom dan kolom terus diisi agar silika gel tidak kering. Larutan yang keluar dari kolom ditampung pada tabung reaksi dengan masing-masing tabung reaksi berisi ± 3 mL. Larutan dalam tabung reaksi kemudian dikeringkan untuk menghasilkan residu ekstrak. Fraksi hasil kromatografi Kolom KK dilakukan pengujian KLT untuk penggabungan fraksi dengan mengacu pada kesamaan pola kromatogram, dan setiap fraksi penggabungan yang terbentuk dikeringkan dengan aerator di ruang asam, dihitung rendamennya, serta diuji aktivitas antioksidan dengan menggunakan metode DPPH Yeh dan Cen 1995. Gambar 10 Diagram alir fraksinasi dengan kromatografi kolom. Larutan silika gel dimasukkan ke dalam kolom Dijenuhkan selama 30-60 menit Larutan ektrak terpilih dimasukkan ke dalam kolom Kran dibuka Kolom terus dialiri eluen Ekstrak aktif Eluen dikeluarkan silica gel tidak boleh kering Larutan ditampung pada tabung reaksi ±10 ml Pembuatan larutan ekstrak terpilih 1 g ekstrak terpilih + 3 ml eluen Larutan silica gel + eluen 1: 1 wv

3.3.2.5 Identifikasi senyawa antioksidan Willard et al. 1988

Fraksi terpilih dengan nilai aktivitas antioksidan yang tertinggi dilanjutkan dengan mengidentifikasi senyawa antioksidan menggunakan Liquid chromatography mass spectrometry LC-MS Agilent Technologies dilakukan untuk mendapatkan bobot molekul dan rumus molekul yang sangat membantu dalam elusidasi struktur molekul. Analisis yang dilakukan pada tahap identifikasi senyawa aktif, yaitu memilih senyawa yang memiliki puncak tinggi, kemudian dicocokkan dengan senyawa yang ada pada database MarinLit Blunt and Blunt 2008. 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Penelitian Tahap Pertama 4.1.1 Rendemen daging tambelo Hasil pengukuran rendemen daging tambelo pada Tabel 2 menunjukkan bahwa tambelo segar setelah preparasi 40,00 dan setelah dikeringkan rendemen berubah menjadi semakin kecil yang disebabkan banyaknya kandungan air yang menguap. Jumlah rendemen setelah dikeringkan sebesar 22,73. Penurunan rendemen tambelo disebabkan penguapan kandungan air akibat bahan mengalami tekanan vakum yang sangat tinggi setelah dibekukan, air akan tersublimasi dan bahan yang tidak tersublimasi berubah menjadi padat atau kering. Hal ini juga menunjukkan bahwa organisme perairan termasuk tambelo dan ikan ini memiliki kandungan air yang tinggi sehingga diperlukan penanganan yang bagus untuk mengurangi kerusakan pada bahan beku. Semakin tinggi rendemen maka semakin tinggi nilai ekonomisnya sehingga lebih efektif. Tabel 2 Rendemen daging tambelo Sampel Berat segar Berat kering Tambelo utuh 2200 gram Daging tambelo 40,00 22,73

4.1.2 Kandungan proksimat tambelo

Hasil analisis proksimat dari daging segar tambelo dan serbuk kering tambelo, meliputi kadar air, protein, lemak, abu, dan karbohidrat. Kandungan proksimat daging tambelo dapat dilihat pada Tabel 3. Tabel 3 Kandungan proksimat daging tambelo Proksimat Segar Kering Tambelo Temilok a Tambelo Kerang mas ngur b Kadar air 82,72±0,01 73,60 6,63±0,01 7,8 Protein 7,21±0,31 1,04 42,77±2,01 56,08 Lemak 0,28±0,04 4,29 14,27±0,22 5,95 Abu 2,07±0,27 4,05 5,88±1,04 7,88 Karbohidrat 7,72±0,62 17,02 30,45±2,83 21 Sumber : a Syaputra 2007 , b Waranmaselembun 2007 Kadar air merupakan jumlah air yang terkandung di dalam bahan pangan dan ikut menentukan kesegaran dan daya awet bahan pangan tersebut. Kadar air