Uji aktivitas antioksidan Yeh dan Cen 1995 Fraksinasi senyawa antioksidan
kromatografi lapis tipis KLT. Kombinasi yang digunakan adalah pelarut kloroform:metanol dengan perbandingan 9:1 mL, pelarut heksan : etil asetat
dengan perbandingan 1:1 mL dan pelarut kloroform : metanol dengan perbandingan 17:3 mL, pelarut heksan:etil asetat dengan perbandingan 8:2 dan
n-heksana:kloroform 3:2, untuk memilih eluen terbaik dicoba dengan berbagai eluen n-heksana, kloroform, etil asetat, dan metanol. Ekstrak terpilih sebanyak
0,02 gram dilarutkan dalam 0,5 mL pelarutnya. Larutan ekstrak tersebut kemudian ditotolkan pada plat silika gel 60 F254 dengan panjang l0 cm.
Kombinasi pelarut yang menghasilkan pengembangan spot terbaik digunakan sebagai eluen untuk memfraksinasi ekstrak terpilih dengan kromatografi lapis
tipis maupun kromatografi kolom. Diagram alir fraksinasi dengan metode KLT dapat disajikan pada Gambar 9.
Gambar 9 Diagram alir fraksinasi dengan metode KLT. b Kromatografi kolom KK Gritter et al. l99l
Pelaksanaan kromatografi kolom dilakukan dengan memasang kolom pada statif secara tegak lurus. Kolom diberi glasswool pada bagian bawahnya.
Diagram alir fraksinasi dengan metode kromatografi kolom dapat dilihat pada Gambar 10. Pencucian kolom dilakukan dan pembuatan larutan silika gel silika
gel G40-63 yang akan dimasukkan ke dalam kolom sebelum ekstrak dimasukkan ke dalam kolom. Silika gel sebanyak 13-15 gram dilarutkan pada eluenn
kloroform : metanol = 9:1 sehingga diperoleh larutan silika gel. Semua larutan silika gel masuk ke dalam kolom, lalu dilakukan penjenuhan silika gel dalam
kolom selama 30-60 menit. Pada proses penjenuhan, bagian atas kolom ditutup
Ekstrak aktif
CHCl
3
:MeOH 9:1ml
CHCl
3
:MeOH 17:3 ml
terbentuknya spot terbanyak Heksan:EtOH
1:1ml Heksan:EtOH
8:2ml Heksan :CHCl
3
3:2 ml
KLT silika gel
dengan aluminium foil untuk mencegah penguapan eluen yang terdapat dalam kolom sehingga silika gel tetap dalam kondisi basah.
Ekstrak yang akan difraksinasi adalah ekstrak terpilih sebesar 1 gram dan dilarutkan pada pelarut asal sebanyak 3 mL. Silika gel harus jenuh sebelum
ekstrak dimasukkan dan setelah silika gel jenuh maka kran kolom dibagian bawah kolom dibuka kembali setelah semua ekstrak masuk ke dalam kolom. Ekstrak
dibiarkan mengalir ke bagian penjerap kolom dan kolom terus diisi agar silika gel tidak kering.
Larutan yang keluar dari kolom ditampung pada tabung reaksi dengan masing-masing tabung reaksi berisi ± 3 mL. Larutan dalam tabung reaksi
kemudian dikeringkan untuk menghasilkan residu ekstrak. Fraksi hasil kromatografi Kolom KK dilakukan pengujian KLT untuk penggabungan fraksi
dengan mengacu pada kesamaan pola kromatogram, dan setiap fraksi penggabungan yang terbentuk dikeringkan dengan aerator di ruang asam, dihitung
rendamennya, serta diuji aktivitas antioksidan dengan menggunakan metode DPPH Yeh dan Cen 1995.
Gambar 10 Diagram alir fraksinasi dengan kromatografi kolom.
Larutan silika gel dimasukkan ke dalam kolom Dijenuhkan selama 30-60 menit
Larutan ektrak terpilih dimasukkan ke dalam kolom
Kran dibuka
Kolom terus dialiri eluen
Ekstrak aktif Eluen dikeluarkan silica gel tidak boleh kering
Larutan ditampung pada tabung reaksi ±10 ml Pembuatan larutan ekstrak terpilih
1 g ekstrak terpilih + 3 ml eluen Larutan silica gel + eluen 1: 1 wv