Kapang Bakteri Produksi Enzim

3.2.4 Pembuatan Kurva Pertumbuhan

Pola pertumbuhan atau kurva pertumbuhan diperoleh dengan metode turbidimetri, yaitu melihat jumlah bakteri dengan mengukur kekeruhan inokulum menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 660 nm OD 660 . Prinsip dasar metode turbidimetri adalah jika cahaya mengenai sel, maka cahaya dipantulkan dan cahaya yang tidak mengenai sel akan diteruskan. Jumlah cahaya yang diteruskan proporsional berbanding lurus dengan transmitan, sedangkan cahaya yang dipantulkan berbanding terbalik dengan transmitan atau berbanding lurus dengan absorbansi Kosim dan Putra 2009. Pembuatan kurva pertumbuhan pada penelitian ini hanya dilakukan pada isolat bakteri. Isolat bakteri yang menghaslkan zona bening pada medium skim milk agar dikulturkan pada medium Nutrient Agar dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang. Setelah diinkubasi, sebanyak 1 ose isolat diinokulasikan ke dalam medium prekultur berisi nutrient broth yang telah ditambahkan kasein dan diinkubasi menggunakan shaker incubator 150 rpm selama 24 jam pada suhu ruang. Selanjutnya, kultur tersebut dimasukkan ke dalam medium kultur berisi nutrient broth yang telah ditambahkan kasein lalu diinkubasi menggunakan shaker incubator 150 rpm selama 5 hari pada suhu ruang dan dilakukan sampling setiap 24 jam. Hasil sampling kemudian diukur pertumbuhan selnya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 660 nm. Nilai absorbansi setiap pengukuran dicatat sebagai indikator pertumbuhan sel inokulum.

3.2.5 Produksi Enzim

3.2.5.1 Kapang

Produksi enzim dilakukan dengan metode fermentasi cair. Isolat kapang yang menghaslkan zona bening pada medium skim milk agar dikulturkan pada medium Malt Extract Agar dan diinkubasi selama 48 jam pada suhu ruang. Setelah diinkubasi, sebanyak 1 ose isolat diinokulasikan ke dalam medium prekultur berisi Malt Extract Broth yang telah ditambahkan kasein dan diinkubasi menggunakan shaker incubator 150 rpm selama 48 jam pada suhu ruang. Selanjutnya, kultur tersebut dimasukkan ke dalam medium kultur berisi Malt Extract broth yang telah ditambahkan kasein lalu diinkubasi menggunakan shaker incubator 150 rpm selama 5 hari pada suhu ruang dan dilakukan sampling setiap 24 jam. Hasil sampling tersebut disentrifugasi kemudian diambil supernatannya untuk memperoleh ekstrak enzim yang akan dianalisis. Ekstrak enzim disentrifugasi dengan paling sedikit dua kali sebelum dianalisis untuk mencegah adanya padatan yang masih terbawa pada saat pemisahan ekstrak. Ekstrak enzim disimpan dalam eppendorf pada suhu 4 o C untuk menjaga stabilitasnya sebelum pengukuran. Ekstrak enzim tersebut selanjutnya dianalisis aktivitas penggumpalan susu dan proteasenya.

3.2.5.2 Bakteri

Produksi enzim dilakukan dengan metode fermentasi cair. Isolat bakteri yang menghaslkan zona bening pada medium skim milk agar dikulturkan pada medium Nutrient Agar dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang. Setelah diinkubasi, sebanyak 1 ose isolat diinokulasikan ke dalam medium prekultur berisi Nutrient Broth yang telah ditambahkan kasein dan diinkubasi menggunakan shaker incubator 150 rpm selama 24 jam pada suhu ruang. Selanjutnya, kultur tersebut dimasukkan ke dalam medium kultur berisi Nutrient Broth yang telah ditambahkan kasein lalu diinkubasi menggunakan shaker incubator 150 rpm selama 5 hari pada suhu ruang dan dilakukan sampling setiap 24 jam. Hasil sampling tersebut disentrifugasi kemudian diambil supernatannya untuk memperoleh ekstrak enzim yang akan dianalisis. Ekstrak enzim disentrifugasi dengan paling sedikit dua kali sebelum dianalisis untuk mencegah adanya padatan yang masih terbawa pada saat pemisahan ekstrak. Ekstrak enzim disimpan dalam eppendorf pada suhu 4 o C untuk menjaga stabilitasnya sebelum pengukuran. Ekstrak enzim tersebut selanjutnya dianalisis aktivitas penggumpalan susu dan proteasenya.

3.3 Prosedur Analisis

3.3.1 Pengukuran Aktivitas Penggumpalan Susu Arima et al 1970

Aktivitas penggumpalan susu ditentukan berdasarkan uji visual dari pembentukan gumpalan susu pertama kali akibat penambahan enzim yang dinotasikan dalam Soxhlet Unit SU. Satu SU didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat menggumpalkan 1 ml campuran yang mengandung 0.1 g susu skim dan 0.00111 g CaCl 2 dalam 40 menit pada suhu 35 o C. Sebanyak 0.5 mL enzim ditambahkan ke dalam 5 ml susu skim 10 g susu skim100 mL 0.01 M CaCl 2 yang telah diinkubasi ada suhu 40 o C selama 5 menit. Campuran tersebut diaduk hingga terbentuk gumpalan. Pengukuran aktivitas enzim milk-clotting menggunakan rumus perhitungan pada persamaan 1. Aktivitas enzim milk-clotting MCA= 1 Keterangan: MCA = aktivitas enzim milk-clotting SU T = waktu pertama kali terbentuk gumpalan susu detik D = faktor pengenceran