3.3.2 Pengukuran Aktivitas Protease Lowry 1951
Aktivitas protease ditentukan melalui metode standar Lowry yang dimodifikasi Meloan dan Pomeranz 1973. Prinsip kerja metode ini adalah reduksi Cu
2+
menjadi Cu
+
oleh tirosin, triptofan, dan sistein yang terdapat dalam protein. Ion Cu
+
bersama dengan fosfotungstat dan fosfomolibdat reagen Lowry E membentuk warna biru, sehingga dapat menyerap cahaya Lowry et al 1951. Warna biru
yang terbentuk kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 660 nm menggunakan spektrofotometer. Pada pengukuran ini digunakan larutan Bovine Serum Albumin BSA sebagai
standar. Standar BSA dibuat menjadi beberapa konsentrasi dan direaksikan dengan Na
2
CO
3
0.4 M dan 0.1 ml fenol folin. Hasil reaksi diinkubasi pada suhu 37°C selama 20 menit, kemudan diukur
absorbansinya pada panjang gelombang 660 nm. Hasil absorbansi beberapa konsentrasi BSA dibuat persamaan garis lurus yang kemudian digunakan sebagai persamaan garis kurva standar.
Untuk pengukuran aktivitas protease sampel, sebanyak 0,2 ml substrat kasein 0,1 direaksikan dengan enzim sebanyak 0,1 mL, kemudian campuran tersebut dihomogenkan dengan vorteks dan
diinkubasi di shaker incubator selama 20 menit pada suhu 37°C. Setelah diinkubasi selama 20 menit, campuran tersebut ditambahkan dengan TCA 0,4 M sebanyak 0,25 mL kemudian dihomogenkan
dengan vorteks dan diinkubasi pada shaker incubator selama 20 menit pada suhu 37°C. Setelah diinkubasi, campuran tersebut dipindahkan ke dalam ependorf 1,5 mL kemudian disentrifugasi selama
10 menit dengan kecepatan 10.000 rpm. Setelah disentrifugasi, sebanyak 0,1 ml supernatan diambil dan dimasukkan pada tabung reaksi baru. Supernatan yang baru ditambahkan dengan 0,5 ml Na
2
CO
3
0.4 M dan 0.1 ml fenol folin, dihomogenkan dengan vorteks dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 20 menit. Setelah diinkubasi, campuran tersebut diukur absorbansinya pada panjang gelombang 660 nm.
Pengukuran aktivitas protease menggunakan rumus pada persamaan 2. Satu unit U aktivitas protease didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat mengkatalisis reaksi pelepasan 1 μmol tirosin per
menit.
Aktivitas protease PA = X x FP x 2
Keterangan : PA
= Protease activity UmL X
= Konsentrasi enzim mgmL FP
= Faktor pengenceran V
= Volume enzim yang dianalisis mL T
= waktu inkubasi menit
3.2.3 Rasio Aktivitas Penggumpalan Susu terhadap Protease
Rasio aktivitas penggumpalan susu terhadap protease merupakan faktor yang menentukan apakah mikroba tersebut dapat digunakan sebagai penghasil alternatif enzim penggumpal susu. Isolat
yang terpilih merupakan isolat yang memiliki aktivitas penggumpalan tinggi dengan aktivitas protease rendah sehingga menghasilkan rasio yang tinggi. Perhitungan rasio aktivitas penggumpalan susu
terhadap protease menggunakan rumus perhitungan pada persamaan 3.
R = 3
Keterangan : MCA
: Milk Clotting Activity ; Aktivitas penggumpalan susu SUmL PA
: Protease Activity ; Aktivitas protease UmL
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Isolasi Mikroba dari Pangan Fermentasi
Teknik isolasi pada penelitian ini menggunakan cara pengenceran bertingkat dengan metode cawan permukaan agar setelah inkubasi terlihat koloni-koloni tunggal tersebar pada permukaan
medium agar. Medium isolasi untuk memperoleh koloni tunggal menggunakan medium selektif skim milk agar. Skim milk agar merupakan medium selektif yang umum digunakan untuk memperoleh
mikroba penghasil protease pada medium agar. Koloni mikroba akan membentuk zona bening sebagai hasil perubahan kasein menjadi senyawa nitrogen yang larut Hidayat et al 2006. Beberapa genus
mikroba penghasil protease antara lain Bacillus, Clostridium, Pseudomonas, Proteus, Streptococcus, Micrococcus, berbagai jamur, khamir Hidayat et al 2006.
Isolasi diakukan terhadap lima sampel pangan fermentasi yaitu tauco, tempe, oncom merah, tape ketan, dan asinan sawi. Sampel diperoleh dari pasar serba ada yang bersih dan higienis sehingga
diharapkan sampel terhindar dari kontaminasi mikroba luar dan mikroba yang diisolasi benar-benar berasal dari sampel.
a b c
d e
Gambar 6. Sampel pangan fermentasi yang digunakan sebagai sumber isolat: oncom merah a, tempe b, tape ketan c, tauco d, asinan sawi e
Dari kelima sampel diperoleh 4 isolat bakteri dengan ciri koloni berbeda. Penentuan ciri koloni untuk bakteri umumnya berdasarkan pengamatan morfologi yaitu bentuk, ukuran, warna, dan tepian
margin. Beberapa isolat yang berhasil diisolasi dapat dilihat pada Tabel 2. Isolat tersebut merupakan hasil isolasi dari tauco dan asinan sawi yang kemungkinan merupakan mikroba yang berperan dalam
proses fermentasi bahan pangan itu sendiri. Proses fermentasi tauco ada dua tahap, yaitu fermentasi oleh kapang dan fermentasi dalam larutan garam oleh bakteri asam laktat dan khamir. Nurwitri et al
2007 menjelaskan bahwa dalam bakteri yang tumbuh selama fermentasi garam pada pembuatan
Kategori