3.2.5.2 Bakteri
Produksi enzim dilakukan dengan metode fermentasi cair. Isolat bakteri yang menghaslkan zona bening pada medium skim milk agar dikulturkan pada medium Nutrient Agar dan diinkubasi
selama 24 jam pada suhu ruang. Setelah diinkubasi, sebanyak 1 ose isolat diinokulasikan ke dalam medium prekultur berisi Nutrient Broth yang telah ditambahkan kasein dan diinkubasi menggunakan
shaker incubator 150 rpm selama 24 jam pada suhu ruang. Selanjutnya, kultur tersebut dimasukkan ke dalam medium kultur berisi Nutrient Broth yang telah ditambahkan kasein lalu diinkubasi
menggunakan shaker incubator 150 rpm selama 5 hari pada suhu ruang dan dilakukan sampling setiap 24 jam. Hasil sampling tersebut disentrifugasi kemudian diambil supernatannya untuk
memperoleh ekstrak enzim yang akan dianalisis. Ekstrak enzim disentrifugasi dengan paling sedikit dua kali sebelum dianalisis untuk mencegah adanya padatan yang masih terbawa pada saat pemisahan
ekstrak. Ekstrak enzim disimpan dalam eppendorf pada suhu 4
o
C untuk menjaga stabilitasnya sebelum pengukuran. Ekstrak enzim tersebut selanjutnya dianalisis aktivitas penggumpalan susu dan
proteasenya.
3.3 Prosedur Analisis
3.3.1 Pengukuran Aktivitas Penggumpalan Susu Arima et al 1970
Aktivitas penggumpalan susu ditentukan berdasarkan uji visual dari pembentukan gumpalan susu pertama kali akibat penambahan enzim yang dinotasikan dalam Soxhlet Unit SU. Satu SU
didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat menggumpalkan 1 ml campuran yang mengandung 0.1 g susu skim dan 0.00111 g CaCl
2
dalam 40 menit pada suhu 35
o
C. Sebanyak 0.5 mL enzim ditambahkan ke dalam 5 ml susu skim 10 g susu skim100 mL 0.01
M CaCl
2
yang telah diinkubasi ada suhu 40
o
C selama 5 menit. Campuran tersebut diaduk hingga terbentuk gumpalan. Pengukuran aktivitas enzim milk-clotting menggunakan rumus perhitungan pada
persamaan 1.
Aktivitas enzim milk-clotting MCA= 1
Keterangan: MCA
= aktivitas enzim milk-clotting SU T
= waktu pertama kali terbentuk gumpalan susu detik D
= faktor pengenceran
3.3.2 Pengukuran Aktivitas Protease Lowry 1951
Aktivitas protease ditentukan melalui metode standar Lowry yang dimodifikasi Meloan dan Pomeranz 1973. Prinsip kerja metode ini adalah reduksi Cu
2+
menjadi Cu
+
oleh tirosin, triptofan, dan sistein yang terdapat dalam protein. Ion Cu
+
bersama dengan fosfotungstat dan fosfomolibdat reagen Lowry E membentuk warna biru, sehingga dapat menyerap cahaya Lowry et al 1951. Warna biru
yang terbentuk kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 660 nm menggunakan spektrofotometer. Pada pengukuran ini digunakan larutan Bovine Serum Albumin BSA sebagai
standar. Standar BSA dibuat menjadi beberapa konsentrasi dan direaksikan dengan Na
2
CO
3
0.4 M dan 0.1 ml fenol folin. Hasil reaksi diinkubasi pada suhu 37°C selama 20 menit, kemudan diukur
absorbansinya pada panjang gelombang 660 nm. Hasil absorbansi beberapa konsentrasi BSA dibuat persamaan garis lurus yang kemudian digunakan sebagai persamaan garis kurva standar.
Untuk pengukuran aktivitas protease sampel, sebanyak 0,2 ml substrat kasein 0,1 direaksikan dengan enzim sebanyak 0,1 mL, kemudian campuran tersebut dihomogenkan dengan vorteks dan
diinkubasi di shaker incubator selama 20 menit pada suhu 37°C. Setelah diinkubasi selama 20 menit, campuran tersebut ditambahkan dengan TCA 0,4 M sebanyak 0,25 mL kemudian dihomogenkan
dengan vorteks dan diinkubasi pada shaker incubator selama 20 menit pada suhu 37°C. Setelah diinkubasi, campuran tersebut dipindahkan ke dalam ependorf 1,5 mL kemudian disentrifugasi selama
10 menit dengan kecepatan 10.000 rpm. Setelah disentrifugasi, sebanyak 0,1 ml supernatan diambil dan dimasukkan pada tabung reaksi baru. Supernatan yang baru ditambahkan dengan 0,5 ml Na
2
CO
3
0.4 M dan 0.1 ml fenol folin, dihomogenkan dengan vorteks dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 20 menit. Setelah diinkubasi, campuran tersebut diukur absorbansinya pada panjang gelombang 660 nm.
Pengukuran aktivitas protease menggunakan rumus pada persamaan 2. Satu unit U aktivitas protease didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat mengkatalisis reaksi pelepasan 1 μmol tirosin per
menit.
Aktivitas protease PA = X x FP x 2
Keterangan : PA
= Protease activity UmL X
= Konsentrasi enzim mgmL FP
= Faktor pengenceran V
= Volume enzim yang dianalisis mL T
= waktu inkubasi menit
3.2.3 Rasio Aktivitas Penggumpalan Susu terhadap Protease
Kategori