Karakterisasi Genomik Fragmen Mikrosatelit
Hasil amplifikasi PCR dari tanaman A.microcarpa ini, selanjutnya digunakan untuk mengetahui perbedaan pola karakter mikrosatelit antara tanaman
yang telah diinokulasi maupun tidak diinokulasi dan juga pada tanaman muda anakan. Sampel yang disekuens dari tingkat semai adalah sampel A dan C,
untuk yang diinokulasi adalah sampel pohon 9 dan 11 sedang yang tidak diinokulasi berasal dari pohon 12 dan 15.
Produk amplifikasi yang diharapkan dalam penelitian ini berkisar antara 158-224 bp. Pada penelitian ini sampel yang akan disekuensing sebanyak 8 buah
dengan dua lokus, sehingga untuk masing-masing populasi hanya diujikan pada 2 lokus. Pemilihan sampel yang akan disekuensing berdasarkan frekwensi alel dan
tingkat kemiripan band antar populasi.
Kegiatan ini dilakukan untuk mendapatkan gambaran variasi urutan basa DNA yang diperoleh dari hasil perunutan sekuensing produk PCR dengan DNA
cetakan template yang berasal dari genom A.microcarpa dan primer mikrosatelit dari tanaman A.crassna. Proses sekuensing produk PCR menggunakan mesin
perunutan otomatis ABI PRISM 377 Applied Biosystems, Foster City, CA, USA. Kegiatan perunutan sequencing nukleotida dilaksanakan di 1
st
BASE Laboratories Sdn.Bhd., Malaysia.
http:www.base-asia.com
Urutan basa yang diperoleh dari hasil sequencing selanjutnya dianalisis dengan program BLASTn Basic Local Alignment and Search Tool for
Nucleotida http:blast.ncbi.nlm.nih.govBlast.cgi untuk mengetahui kesesuaian urutan basa atau asam amino yang didapatkan dari suatu gen atau protein dengan
urutan lain yang ada dalam bank data gen. Fragmen DNA hasil PCR yang diurutkan dianalisis dengan program BLASTn. Analisis dengan program ini
dilakukan untuk mengetahui kesesuaian antara urutan basa yang didapatkan dengan urutan yang terdapat dalam bank data gen. Urutan yang didapatkan
diharapkan memiliki tingkat homologi yang tinggi e-value 10 -4 dengan gen yang sesuai Claverie dan Notredame 2003.
Analisis hubungan kemiripan susunan urutan nukleotida ditentukan dengan metode aligment pensejajaran dengan perangkat lunak ClustalW
EMBL-European Bioinformatics Institute. Jarak genetik digunakan untuk membandingkan setiap individu dari individu lain berdasarkan pensejajaran
fragmen mikrosatelit dengan menggunakan perangkat lunak ClustalW dalam situs EBI http:www.ebi.ac.uk. Hasil Clustalw berupa cladogram atau pohon filogeni
selanjutnya
dibaca menggunakan
perangkat lunak
Mega 5.
http:www.megasoftware.net
4.3 Hasil Karakterisasi Aquilaria microcarpa Berdasarkan Marka Mikrosatelit
Hasil pengujian amplifikasi fragmen DNA dengan menggunakan empat pasang primer mikrosatelit pada populasi A.microcarpa, menunjukkan bahwa
hanya dua primer yang mampu mengamplifikasi DNA dengan baik. Adapun deskripsi DNA elektropherogram dari kedua lokus disajikan pada Gambar 4.1.
.
Gambar 4.1 Pola amplifikasi PCR dengan primer 71Pa17 pada tanaman Aquilaria microcarpa anakan A, tidak diinokulasi N dan diinokulasi i
Dua pasang primer lainnya yakni 10 PA 17 dan 16 PA 17, tidak menghasilkan produk amplifikasi. Eurlings et al. 2010 melakukan pengujian
terhadap 12 primer microsatelit pada tanaman A. crassna, 4 primer diantaranya mengamplifikasi sampel dengan pola polimorfik, satu primer teramplifikasi
monomorfik dan 7 primer lainnya tidak teramplifikasi. Kegagalan amplifikasi dalam penelitian ini dimungkinkan karena adanya ketidak sesuaian sekuen primer
dengan sekuen DNA cetakan, seperti dilaporkan Eurlings et al. 2010 dimana dari beberapa sampel A. crasna untuk lokasi berbeda, pasangan primer yang
dirancangnya tidak semua dapat mengamplifikasikan sampel tanaman uji. Primer yang digunakan dalam penelitian ini telah dilaporkan keberhasilannya dalam
mengamplifikasi beberapa DNA tanaman penghasil gaharu dari berbagai wilayah Siburian 2009; Eurlings et al. 2010; Irmayanti 2011. Pasangan primer
mikrosatelit 6 PA 18 dan 71 PA 17 yang diuji pada A. microcarpa mampu mengamplifikasi 5 hingga 6 alel. Alel tersebut bersifat polimorfis seperti disajikan
pada Tabel 4.3.
Tabel 4.3 Kemampuan amplifikasi Primer mikrosatelit pada Aquilaria microcarpa
Nama Primer
Ukuran Fragmen
bp Kemampuan
amplifikasi Perkiraan Panjang Fragmen
bp Jumlah
alel Keterangan
6 PA 18 10 PA 17
16 PA 17 71 PA 17
180-210 152-156
143-155 152-224
+ -
- +
184,194,198,202,222 -
- 158,166,178,194,198,202,222
5 -
- 6
Polimorfik -
- Polimorfik
Keterangan: + : teramplifikasi, -: tidak teramplifikasi
Suatu lokus gen dikatakan polimorfik jika sekurang-kurangnya ada dua variasi alel yang berbeda dan frekwensi dari alel yang sering ditemukan kurang
dari 95 Finkeldey 2005. Ukuran maupun jumlah alel dilakukan menurut Leung et al. 1993 dengan asumsi bahwa semua pita DNA dengan laju migrasi
yang sama, digolongkan sebagai lokus yang homolog. Data profil DNA ini kemudian diterjemahkan kedalam data matrik jarak berdasarkan nilai
heterosigositas dari populasi yang dibandingkan. Hasil amplifikasi primer
100 bp
200 bp
300 bp A1 A2 A3 A4 N1 N2 N3 N4 I1 I2 I3 I4 M
224 bp 184 bp
210 bp
mikrosatelit ini dapat di gunakan sebagai kandidat marka pada tanaman A. microcarpa.
Panjang fragmen hasil amplifikasi silang dari primer spesifik jenis A.crassna berhasil dilakukan dengan kisaran panjang fragmen bp yang
diharapkan. Syarat utama terjadinya amplifikasi DNA dengan satu jenis primer adalah apabila primer tersebut mempunyai urutan basa nukleotida yang
merupakan komplemen dari kedua untai cetak DNA pada posisi yang berlawanan. Adapun panjang fragmen hasil amplifikasi silang disajikan pada Tabel 4.4.
Tabel 4.4 Panjang fragmen hasil amplifikasi silang pada lokus 6Pa18 dan 71Pa17 Lokus
Alel bp 1
5 2
1 5
4 1
5 8
1 6
6 1
6 8
1 7
1 7
4 1
7 6
1 7
8 1
8 1
8 6
1 9
4 1
9 6
1 9
4 1
9 8
2 2
2 6
2 2
2 2
2 4
6PA18 -
- -
- -
- -
- -
- √ √ √ √ √ √ - √ A
71PA17 - - A A -
- -
- √ - - Ф - Ф Ф Ф - √ Ф
Keterangan : - = ada dalam A.crassna Eurlings et al. 2009, tidak ada dalam penelitian
Φ = tidak ada dalam A.crassna Eurlings et al. 2009, ada dalam penelitian
√ = ada dalam A.crassna Eurlings et al. 2009 dan penelitian
A =
Tidak ada dalam A. crassna, hanya pada lokus tertentu dalam penelitian
Berdasarkan Tabel 4.4 penulisan alel didasarkan pada panjang fragmen, misalnya untuk alel dari populasi inokulasi dapat ditulis I
158
, I
196
, I
198
, I
202,
dan I
222
, begitu pula penulisan nama pada populasi lainnya.
Pengujian F. solani Pada Tingkat Semai A. microcarpa Baill
Hasil pengamatan karakter morfologi A. microcarpa yang diinduksi F. solani pada tingkat semai, menunjukkan variasi ketahanan tanaman terhadap
jenis F. solani yang diujikan sejak minggu pertama penginokulasian, terutama pada jenis F. solani FORDA 512. Hal ini ditandai dengan adanya perubahan
warna daun dari hijau menjadi kuning bahkan mengakibatkan gugur daun, seperti terlihat pada Gambar 4.2 dan Gambar 4.3
Gambar 4.2 Morfologi tanaman setelah 4 hari diinokulasi Fusarium solani FORDA 512
Gambar 4.3 Morfologi daun setelah 8 hari, diinokulasi Fusarium solani FORDA 512
Genotipe setiap semai dan tingkat keparahan inokulasi lima jenis F. solani pada tanaman muda A. microcarpa berdasarkan lokus 6PA18 dan 71Pa17 seperti
disajikan dalam Tabel 4.5. Hasil pengukuran panjang fragmen yang terdeteksi, dimana lokus 6PA18 memiliki 10 variasi genotipe yaitu 184184, 184198,
198198, 198210, 210210, 198198, 198210, 198222, 210210, 210222 sedang untuk lokus 71PA17 memiliki 8 variasi genotipenya diantaranya 158158,
166166, 166178, 178178, 178198, 194195, 194198 dan 198198.
Pengujian ketahanan terhadap suatu spesies tanaman, terkadang menyebabkan pergeseran ketahanan. Dalam pengujian interaksi F.solani terhadap
tanaman A. microcarpa yang dilakukan di kebun percobaan Carita Banten, untuk kode F. solani FORDA 509 menunjukkan tingkat virulensi yang tinggi
dibandingkan dengan kode Fusarium lainnya. Namun berdasarkan nilai rata-rata dan standart deviasi untuk pengamatan pengaruh F. solani pada tanaman muda,
terlihat bahwa pada pengamatan minggu pertama dan kedua F. solani FORDA 512 memiliki tingkat virulensi yang tinggi dan berbeda nyata dengan jenis
F. solani yang lain, terutama pada genotipe 198198, 198222 dan 178178.
