III. BAHAN DAN METODE
A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Kehutanan dan Laboratorium Rekayasa Bioproses Pusat Antar Universitas PAU
Bioteknologi IPB, dalam jangka waktu Oktober 2003 - Februari 2004.
B. Bahan dan Alat
Bahan yang diperlukan dalam pelaksanaan penelitian adalah isolat biakan murni Rhizoctonia sp. merupakan hasil isolasi dari bagian daun tanaman
Toona sureni , spiritus, alkohol 70, NaOH 1, HCl 1, aquades, media
PDA Potato Dextrose Agar, media PSA Potato Sucrose Agar, media PDL Potato Dextrose Liquid dan PSL Potato Sucrose Liquid. Peralatan yang
digunakan meliputi, erlenmeyer, boks isolasi Laminar Air Flow, bunsen, cawan petri, otoclaf, shaker, pisau, pengaduk, kain penyaring, kapas, tisu, cork
borer , alumunium foil, plastic wrap, jarum ose, korek api, kertas saring, oven,
timbangan analitik, mikroskop, gelas preparat, gelas penutup, kamera focus,
pH meter, alat titrasi, alat tulis, alat hitung serta software pengolah data. C. Metode Penelitian
1. Persiapan a. Sumber cendawan
Isolat yang dipergunakan adalah isolat murni cendawan Rhizoctonia sp. yang diisolasi dari daun tanaman Toona sureni yang menunjukkan gejala
penyakit hawar daun pada pesemaian Perhutani Pongpoklandak di Cianjur, Perum Perhutani Unit III Jawa Barat. Isolasi dilakukan dengan menanam
miselium berwarna putih dari permukaan daun yang terserang, kemudian diperbanyak pada medium PDA Potato Dextrose Agar dalam cawan petri
dan dimurnikan.
b. Pemurnian dan peremajaan
Pemurnian dan peremajaan biakan dilakukan sehingga diperoleh biakan yang homogen, bebas dari kontaminasi dan memiliki viabilitas yang
cukup tinggi.
c. Sterilisai peralatan dan ruang inokulasi
Peralatan yang akan digunakan disterilkan dengan otoklaf pada tekanan 1 atm dan suhu 121
о
C selama 15-20 menit, sedangkan untuk sterilisasi cork borer dan jarum ose dilakukan pada saat pelaksanaan
inokulasi dengan cara dibakar pada api bunsen. Strerilisasi ruang inokulasi
laminar air flow dilakukan menggunakan larutan alkohol 70 . 2. Tahap Pelaksanaan
a. Pembuatan Media
•
PDL Potato Dextrose Liquid dan PSL Potato Sucrose Liquid
1. Satu liter PDL dan PSL dibuat dari 200 g kentang yang diiris halus dan
direbus dalam aquades lalu diambildisaring ekstraknya, kemudian ditambahkan dekstrosaglukosa 20 g untuk membuat larutan PDL, atau
20 g sukrosa untuk membuat larutan PSL lalu ditambahkan lagi aquades, sehingga larutan menjadi 1000 ml.
2. Larutan dimasukkan ke dalam erlenmeyer yang telah dipersiapkan,
masing-masing sebanyak 100 ml, kemudian masing-masing larutan dalam erlenmeyer dititrasi dengan HCl dan NaOH 1 untuk mengatur
pH media menjadi 2, 4, 6, 8, 10, 12. 3.
Media PDL dan PSL disterilkan menggunakan otoklaf pada tekanan 1 atm dan suhu 121
о
C selama 15 menit. 4.
Media larutan didinginkan.
•
PDA Potato Dextrose Agar dan PSA Potato Sucrose Agar
1. Satu liter PDA dan PSA dibuat dari 200 g kentang yang diiris halus dan
direbus dalam aquades lalu diambildisaring ekstraknya, kemudian ditambahkan dekstrosaglukosa 20 g untuk membuat PDA, atau 20 g
sukrosa untuk membuat PSA lalu ditambahkan lagi aquades, sehingga larutan menjadi 1000 ml.
2. Larutan dimasukkan ke dalam erlenmeyer yang telah dipersiapkan,
masing-masing sebanyak 100 ml, kemudian masing-masing larutan dalam erlenmeyer dititrasi dengan HCl dan NaOH 1 untuk mengatur
pH media menjadi 2, 4, 6, 8, 10, 12, lalu setelah itu ditambahkan 1.5 g agar.
3. Media disterilkan dengan menggunakan otoklaf pada tekanan 1 atm dan
suhu 121
о
C selama 15 menit. 4.
Media PDA dan PSA dituang ke dalam cawan petri, kemudian didinginkan hingga memadat.
b. Uji Respon Pertumbuhan Biomassa Miselia Rhizoctonia sp.
Kategori