3.7.2. Kriteria Eksklusi
1. Pasien yang diduga onikomikosis dengan liken planus kuku. 2. Pasien yang diduga onikomikosis dengan psoriasis kuku.
3. Pasien yang diduga onikomikosis tipe subungual proksimal 4. Sedang mendapatkan pengobatan onikomikosis berupa anti jamur
topikal dalam 1 minggu terakhir dan anti jamur oral dalam 1 bulan terakhir.
3.8. Alat, Bahan dan Cara Kerja
3.8.1. Alat dan Bahan
1. Alat yang digunakan adalah skalpel, wadah spesimen amplop,ice bag, tabung PCR Biologix, microsentrifuge tube Sorenson, white tip
Biologix, yellow tip Biologix, blue tip Sorenson, micropipet Rainin, kulkas, sentrifuge Biofuge, Jerman, inkubator Mammert,
thermocycler applied biosystem tipe Veriti 96 well thermal cycler, Singapura, aparatus elektroforesis dengan power supply Scie-plas,
UK dan vortex Biosan. 2. Bahan yang digunakan adalah potongan kuku, media Sabaroud’s
dextrose agar, buffer Tris-EDTA Sigma, EDTA Sigma, ekstraksi DNAkit Promega,enzim litikase Sigma, PCR kit Promega,
primerInternal Transcribed Spacer 1 ITS1 dan Internal Transcribed Spacer 4 ITS 4 1
st
Base, gel agarose 2 Promega, isopropanol Merck, etanol 70 Merck, ethidium bromide Promega, penanda
DNA Promega dan enzim restriksi MvaI dan Hae III Fermentas.
Universitas Sumatera Utara
3.8.2. Cara Kerja
1. Pencatatan data dasar Pencatatan data dasar dilakukan oleh peneliti di Departemen Ilmu Kesehatan
Kulit dan Kelamin RSUP H. Adam Malik Medan meliputi identitas penderita seperti nama, jenis kelamin, tempattanggal lahir, alamat dan nomor telepon.
2. Dilakukan anamnesis dan pemeriksaan dermatologis. 3. Pengambilan sampel kuku yang dilakukan oleh peneliti, sampel kuku diambil
dari bagian kuku yang terinfeksi dengan menggunakan gunting kuku atau skalpel no. 15, yang terlebih dahulu telah dibersihkan dengan alkohol 70.
Potongan kuku yang diambil dibagi dalam 2 bagian, untuk dilakukan pemeriksaan kultur jamur ke laboratorium mikrobiologi yang dimasukkan ke
dalam amplop 1, untuk pemeriksaan PCR RFLP dimasukkan dalam amplop 2 ke laboratorium terpadu.
4. Untuk pemeriksaan kultur jamur, potongan kuku dimasukkan dalam 2 media, media yang dapat menapis jamur dermatofita mycobioticmycocel, dan
media yang dapat menumbuhkan jamur non dermatofita PDASDA. Bahan potongan kuku akan diinokulasikan pada media dalam keadaan steril. Media
dieramkan pada temperatur suhu kamar yaitu sekitar 25°C-32°C selama 4-6 minggu. Pengamatan pada minggu I dilakukan tiap hari, minggu II
pengamatan dilakukan kelang 1 hari, minggu III pengamatan 2 kali dalam seminggu. Bila koloni yang tumbuh di media yang mengandung antibiotik
media dipindahkan ke media yang tanpa antibiotik. 5. Spesimen untuk PCR-RFLP dibawa ke Laboratorium terpadu, Fakultas
Kedokteran, Universitas Sumatera Utara untuk diproses:
Universitas Sumatera Utara
a. Spesimen kuku yang diambil kira-kira 1 x 1 cm sampai 1,5 x 1,5 cm, kemudian dimasukkan ke dalam tabung mikro 1,5 ml ditambah 400 µl
lisis buffer. b. Ditambahkan 7,5 µl enzim litikase lalu di vortex.
c. Inkubasi sampel pada 30
o
C selama 30 menit. Kemudian dinginkan pada temperatur ruangan.
d. Ditambahkan dengan 1,5 µl RNAse lalu diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 20 menit
e. Tambahkan 100 µl SDS dan 15 µl proteinase K lalu diinkubasi pada suhu 60
o
C selama 55 menit. f.
Ditambahkan 1ml fenol-kloroform 1:1. g. Disentrifuse pada 13.000 rpm selama 5 menit, lalu supernatan
dipindahkan ke tabung mikro 1,5 ml. h. Ditambahkan 1 ml isoporopanolol dingin lalu tabung dibolak-balik
i. Disentrifuse pada 13.000 rpm selama 5 menit, lalu supernatan
dipindahkan ke tabung mikro 1,5 ml. j.
Buang supernatan. Pellet cell kemudian dicuci dengan memasukkan 300 µl etanol 70, kemudian sentrifus kembali pada 13.000 rpm selama
5 menit. k. Buang supernatan, lalu keringkan pellet cell+ 15 menit, dengan
membalikkan tabung di atas kertas absorban secara hati-hati selama 1 jam lalu ditambahkan 100 µl TE buffer.
l. Kemudian simpan pada suhu 4
o
C selama satu malam dan dapat disimpan pada suhu -20
o
C untuk seterusnya.
Universitas Sumatera Utara
m. Hasil dari ekstraksi DNAdiambil 2 µl dan volume reaksi diambil 23 µl green master mix12,5 µl, primer reverse1 µl, primer forward1 µl,
nuclease free water8,5 µl, DNA templet 2 µl dimasukkan ke dalam tabung PCR. Lalu dimasukkan kedalam mesin termocycler. Preheat pada
suhu 94
o
C, selama 10 menit; denaturasi pada suhu 93
o
C, selama 1 menit; annealing pada suhu 58
o
C, selama 1 menit; extention pada suhu 72
o
C, selama 1 menit rangkaian proses ini dilakukan sebanyak 35 siklus dan
finalextention pada suhu 72
o
C, selama 7 menit. n. Hasil amplifikasi PCR diambil 10 µl,kemudian di running di dalam gel
agarose 2 yang diwarnai dengan ethidium bromide bersamaan dengan penanda DNA, selama 1jam dengan voltase 70 volt.Lalu dibaca dengan
ukuran 500 bp, 600 bp, 780 bp, 720 bp atau 680 bp menggunakan lampu UV yang dihubungkan dengan komputer.
o. Hasil amplifikasi PCR diambil 5 µl dan volume reaksi restriksi diambil 10 µl enzim MvaI 2 µl atau Hae III, buffer 1 µl, nuclease free water
3,8 µl, PCR product 5 µl dimasukkan pada tabung PCR kemudian diinkubasi pada suhu 37
o
C, selama 3 jam. p. Hasil restriksi diambil 10 µl dan di running di dalam gel agarose 2
bersamaan dengan penanda DNA, yang diwarnai dengan ethidium bromide, selama 1 jam 10 menit, voltase 70 volt, kemudian dibaca
dengan masing-masing ukuran dari penggunaaan enzim MvaI dan Hae III, menggunakan lampu UV yang dihubungkan dengan komputer.
Universitas Sumatera Utara
3.9. Defenisi Operasional
Kategori