2. Populasi terjangkau Penderita diduga onikomikosis yang datang ke Poliklinik Ilmu
Kesehatan Kulit dan Kelamin Divisi Mikologi RSUP. H. Adam Malik Medan sejak bulan April 2014.
3.3.2. Sampel
Penderita diduga onikomikosis yang datang ke Poliklinik Ilmu Kesehatan Kulit dan Kelamin Divisi Mikologi RSUP. H. Adam Malik Medan sejak bulan
April 2014 yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi.
3.4. Besar Sampel
Untuk menghitung besar sampel penelitian, maka digunakan rumus sebagai berikut:
Rumus : n =
Zα
2
sen 1 – sen d
2
P
41
Keterangan : n = besar sampel
Zα = tingkat kesalahan ditetapkan sebesar 5 sehingga Zα = 1,96 sen = sensitivitas yang diinginkan dari alat yang diuji nilai diagnostiknya: 99
d = presisi penelitian ditetapkan sebesar 15 P = prevalensi Onikomikosis: 10
4
Universitas Sumatera Utara
Maka : n
= 0,1
2
x 0,15 1,96
2
x 0,99x 1 – 0,99
= 0,01 x 0,15
1,96
2
x 0,99 x 0,01
= 0,01 x 0,15
3,8416x0,99 x 0,01
= 0,0015
0,038
= 25,33 = 25 sampel Jadi jumlah sampel kuku minimal dalam penelitian ini sebanyak 25 pasien.
3.5. Cara Pengambilan Sampel Penelitian
Cara pengambilan sampel dilakukan dengan menggunakan metode consecutive sampling.
3.6. Identifikasi Variabel
3.6.1. Variabel Bebas
Hasil pemeriksaan PCR-RFLP.
3.6.2. Variabel Terikat
Sensitivitas, spesifisitas, positive predictive value, negative predictive value, rasio kemungkinan positif, rasio kemungkinan negatif dan akurasi.
3.7. Kriteria Inklusi dan Eksklusi
3.7.1. Kriteria Inklusi
1. Pasien yang diduga menderita onikomikosis. 2. Bersedia ikut serta dalam penelitian dan menandatangani inform
consent.
Universitas Sumatera Utara
3.7.2. Kriteria Eksklusi
1. Pasien yang diduga onikomikosis dengan liken planus kuku. 2. Pasien yang diduga onikomikosis dengan psoriasis kuku.
3. Pasien yang diduga onikomikosis tipe subungual proksimal 4. Sedang mendapatkan pengobatan onikomikosis berupa anti jamur
topikal dalam 1 minggu terakhir dan anti jamur oral dalam 1 bulan terakhir.
3.8. Alat, Bahan dan Cara Kerja
3.8.1. Alat dan Bahan
1. Alat yang digunakan adalah skalpel, wadah spesimen amplop,ice bag, tabung PCR Biologix, microsentrifuge tube Sorenson, white tip
Biologix, yellow tip Biologix, blue tip Sorenson, micropipet Rainin, kulkas, sentrifuge Biofuge, Jerman, inkubator Mammert,
thermocycler applied biosystem tipe Veriti 96 well thermal cycler, Singapura, aparatus elektroforesis dengan power supply Scie-plas,
UK dan vortex Biosan. 2. Bahan yang digunakan adalah potongan kuku, media Sabaroud’s
dextrose agar, buffer Tris-EDTA Sigma, EDTA Sigma, ekstraksi DNAkit Promega,enzim litikase Sigma, PCR kit Promega,
primerInternal Transcribed Spacer 1 ITS1 dan Internal Transcribed Spacer 4 ITS 4 1
st
Base, gel agarose 2 Promega, isopropanol Merck, etanol 70 Merck, ethidium bromide Promega, penanda
DNA Promega dan enzim restriksi MvaI dan Hae III Fermentas.
Universitas Sumatera Utara
3.8.2. Cara Kerja
1. Pencatatan data dasar Pencatatan data dasar dilakukan oleh peneliti di Departemen Ilmu Kesehatan
Kulit dan Kelamin RSUP H. Adam Malik Medan meliputi identitas penderita seperti nama, jenis kelamin, tempattanggal lahir, alamat dan nomor telepon.
2. Dilakukan anamnesis dan pemeriksaan dermatologis. 3. Pengambilan sampel kuku yang dilakukan oleh peneliti, sampel kuku diambil
dari bagian kuku yang terinfeksi dengan menggunakan gunting kuku atau skalpel no. 15, yang terlebih dahulu telah dibersihkan dengan alkohol 70.
Potongan kuku yang diambil dibagi dalam 2 bagian, untuk dilakukan pemeriksaan kultur jamur ke laboratorium mikrobiologi yang dimasukkan ke
dalam amplop 1, untuk pemeriksaan PCR RFLP dimasukkan dalam amplop 2 ke laboratorium terpadu.
4. Untuk pemeriksaan kultur jamur, potongan kuku dimasukkan dalam 2 media, media yang dapat menapis jamur dermatofita mycobioticmycocel, dan
media yang dapat menumbuhkan jamur non dermatofita PDASDA. Bahan potongan kuku akan diinokulasikan pada media dalam keadaan steril. Media
dieramkan pada temperatur suhu kamar yaitu sekitar 25°C-32°C selama 4-6 minggu. Pengamatan pada minggu I dilakukan tiap hari, minggu II
pengamatan dilakukan kelang 1 hari, minggu III pengamatan 2 kali dalam seminggu. Bila koloni yang tumbuh di media yang mengandung antibiotik
media dipindahkan ke media yang tanpa antibiotik. 5. Spesimen untuk PCR-RFLP dibawa ke Laboratorium terpadu, Fakultas
Kedokteran, Universitas Sumatera Utara untuk diproses:
Universitas Sumatera Utara
a. Spesimen kuku yang diambil kira-kira 1 x 1 cm sampai 1,5 x 1,5 cm, kemudian dimasukkan ke dalam tabung mikro 1,5 ml ditambah 400 µl
lisis buffer. b. Ditambahkan 7,5 µl enzim litikase lalu di vortex.
c. Inkubasi sampel pada 30
o
C selama 30 menit. Kemudian dinginkan pada temperatur ruangan.
d. Ditambahkan dengan 1,5 µl RNAse lalu diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 20 menit
e. Tambahkan 100 µl SDS dan 15 µl proteinase K lalu diinkubasi pada suhu 60
o
C selama 55 menit. f.
Ditambahkan 1ml fenol-kloroform 1:1. g. Disentrifuse pada 13.000 rpm selama 5 menit, lalu supernatan
dipindahkan ke tabung mikro 1,5 ml. h. Ditambahkan 1 ml isoporopanolol dingin lalu tabung dibolak-balik
i. Disentrifuse pada 13.000 rpm selama 5 menit, lalu supernatan
dipindahkan ke tabung mikro 1,5 ml. j.
Buang supernatan. Pellet cell kemudian dicuci dengan memasukkan 300 µl etanol 70, kemudian sentrifus kembali pada 13.000 rpm selama
5 menit. k. Buang supernatan, lalu keringkan pellet cell+ 15 menit, dengan
membalikkan tabung di atas kertas absorban secara hati-hati selama 1 jam lalu ditambahkan 100 µl TE buffer.
l. Kemudian simpan pada suhu 4
o
C selama satu malam dan dapat disimpan pada suhu -20
o
C untuk seterusnya.
Universitas Sumatera Utara
m. Hasil dari ekstraksi DNAdiambil 2 µl dan volume reaksi diambil 23 µl green master mix12,5 µl, primer reverse1 µl, primer forward1 µl,
nuclease free water8,5 µl, DNA templet 2 µl dimasukkan ke dalam tabung PCR. Lalu dimasukkan kedalam mesin termocycler. Preheat pada
suhu 94
o
C, selama 10 menit; denaturasi pada suhu 93
o
C, selama 1 menit; annealing pada suhu 58
o
C, selama 1 menit; extention pada suhu 72
o
C, selama 1 menit rangkaian proses ini dilakukan sebanyak 35 siklus dan
finalextention pada suhu 72
o
C, selama 7 menit. n. Hasil amplifikasi PCR diambil 10 µl,kemudian di running di dalam gel
agarose 2 yang diwarnai dengan ethidium bromide bersamaan dengan penanda DNA, selama 1jam dengan voltase 70 volt.Lalu dibaca dengan
ukuran 500 bp, 600 bp, 780 bp, 720 bp atau 680 bp menggunakan lampu UV yang dihubungkan dengan komputer.
o. Hasil amplifikasi PCR diambil 5 µl dan volume reaksi restriksi diambil 10 µl enzim MvaI 2 µl atau Hae III, buffer 1 µl, nuclease free water
3,8 µl, PCR product 5 µl dimasukkan pada tabung PCR kemudian diinkubasi pada suhu 37
o
C, selama 3 jam. p. Hasil restriksi diambil 10 µl dan di running di dalam gel agarose 2
bersamaan dengan penanda DNA, yang diwarnai dengan ethidium bromide, selama 1 jam 10 menit, voltase 70 volt, kemudian dibaca
dengan masing-masing ukuran dari penggunaaan enzim MvaI dan Hae III, menggunakan lampu UV yang dihubungkan dengan komputer.
Universitas Sumatera Utara
3.9. Defenisi Operasional
1. Pasien diduga onikomikosis pada penelitian ini adalah pasien yang disangkakan mengalami onikomikosis melalui pemeriksaan klinis dengan
gambaran berupa onikomikosis subungual distal dan lateral, onikomikosis distrofik total dan onikomikosis candida. Pasien yang diduga onikomikosis
subungual proksimal tidak digunakan karena pengambilan jaringan dilakukan dengan biopsi plong.
2. Pemeriksaan kultur adalah suatu metode diagnostik terhadap infeksi onikomikosis dengan cara mengkultur materikerokan kuku yang mengalami
infeksi dengan memakai media kultur mycobioticmycocel dan Sabaround Dextrose Agar SDA Potato Dextrose Agar PDA sehingga dengan metode
ini dapat diidentifikasi jenis spesies jamur. 3. Interpretasi hasil pemeriksaan kultur jamur dikatakan positif jika ditemukan
pertumbuhan jamur lalu dilihat dan dinilai koloni jamur tersebut secara makroskopis dan mikroskopis jika tidak ditemukan koloni jamur dikatakan
tidak ada pertumbuhan jamur TAPJ. 4. Psoriasis kuku adalah penyakit psoriasis yang melibatkan kuku berupa pitting
kuku dan diskolorisasi coklat kuning pada bantalan kuku. 5. Liken planus kuku adalah penyakit liken planus yang melibatkan kedua kuku
tangan dan kaki dengan gambaran onikolisis, diskolorisasi kuning dan adanya hiperkeratosis subungual disertai dengan kelainan pada kulit dan mukosa yang
mempunyai gambaran khas yaitu lesi Wickham striae. 6. PCR-RFLP merupakan suatu teknik sintesis dan amplifikasi DNA secara in
vitro dengan penambahan enzim setelah amplifikasi.
Universitas Sumatera Utara
7. Primer ITS1 dan ITS4 merupakan primer yang digunakan pada penelitian ini, dengan urutan pada primer ITS1 5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’
dan primer ITS4 5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’ yang akan dibaca pada gel agarose 2 dengan ukuran 500 bp, 600 bp, 680 bp, 780 bp
dan 720 bp. 8. Interpretasi hasil pemeriksaan PCR dikatakan positif jika dijumpai potongan
DNA dan dikatakan negatif jika tidak dijumpai potongan DNA. 9. Enzim MvaI merupakan enzim ekstraksi yang digunakan pada penelitian ini,
yang membaca T. Mentagrophytes dengan ukuran 400 bp, 360 bp, 250 bp, 160 bp dan 120 bp; T. Rubrum dengan ukuran 370 bp dan 160 bp; Trichophyton
TonsuransT. Tonsurans dengan ukuran 360 bp dan 250 bp; T. Verrucosum dengan ukuran 450 bp, 350 bp dan 200 bp; dan E. Floccosum dengan ukuran
360 bp, 230 bp dan 170 bp pada gel agarose 2. 10. Enzim Hae III merupakan enzim ekstraksi yang digunakan pada penelitian ini,
yang membaca jamur nondermatofita mold Syctalidium spp, Aspergillus, Scopuloriopsis dan Fusarium dengan ukuran 300-600 bp dan yeast seperti
Candida Albicans dengan ukuran 90-430 bp. 11. Interpretasi hasil pemeriksaan PCR-RFLP dikatakan tidak terdeteksi jika
tidak dijumpai potongan DNA yang sesuai dengan basepair jamur patogen penyebab onikomikosis.
12. Anti jamur topikal merupakan obat-obat anti jamur yang dioleskan pada daerah kuku yang hanya mempengaruhi daerah yang dioleskan tersebut; obat-
obat anti jamur topikal tersebut seperti golongan siklopiroks dan amorolfin.
Universitas Sumatera Utara
13. Anti jamur oral merupakan obat-obat anti jamur yang diberikan secara oral yang memberikan efek sistemik; obat-obat anti jamur oral tersebut seperti
golongan azol itrakonazol dan flukonazol dan non azol griseofulvin dan terbinafin.
14. Sensitivitas adalah kemampuan alat diagnostik untuk mendeteksi suatu penyakit yang diperoleh dari perhitungan proporsi subjek yang sakit dengan
hasil uji diagnotik positif positif benar dibanding seluruh subjek yang sakit positif benar + negatif semu.
15. Spesifisitas adalah kemampuan alat diagnostik untuk menentukan bahwa subjek tidak sakit, yang diperoleh dari perhitungan proporsi subjek sehat yang
memberikan hasil uji diagnostik negatif negatif benar dibandingkan dengan seluruh subjek yang tidak sakit negatif benar + positif semu.
16. Positive Predictive Value PPV adalah probabilitas seseorang benar-benar menderita penyakit bila hasil uji diagnostiknya positif yang diperoleh dari
perbandingan antara subjek dengan hasil uji positif benar dengan positif benar ditambah positif semu.
17. Negative Predictive Value NPV adalah probabilitas seseorang tidak menderita penyakit bila hasil ujinya negatif yang diperoleh dari perbandingan
antara subjek dengan hasil uji negatif benar dengan negatif semu ditambah negatif benar.
18. Rasio Kemungkinan Positif RKP adalah perbandingan antara hasil positif pada kelompok yang memang positif dibandingkan dengan hasil positif pada
kelompok yang negatif. Secara matematis rasio kemungkinan positif sama dengan nilai sensitivitas dibagi 1-spesifisitas
Universitas Sumatera Utara
19. Rasio Kemungkinan Negatif RKN adalah perbandingan antara hasil negatif pada kelompok yang positif dibandingkan dengan hasil negatif pada kelompok
yang negatif. Secara matematis rasio kemungkinan positif sama dengan nilai sensitivitas dibagi 1-spesifisitas. Secara matematis rasio kemungkinan negatif
sama dengan 1- sensitivitas dibagi spesifisitas. 20. Akurasi adalah proporsi hasil uji yang positif benar dan negatif benar.
Universitas Sumatera Utara
3.10. Kerangka Operasional
