Rancangan Percobaan Peubah yang Diukur

37

B. Peralatan

Alat-alat yang digunakan adalah autoclave, laminar, cawan petri, tabung reaksi, gelas ukur, alumunium foil, kapas, pengaduk, erlenmeyer, timbangan digital, spoit, lampu spirtus, osse, plastik tahan panas, karet tahan panas termometer, higrometer, incubator, alat penghitung, spidol transparan, jangka sorong, nampan plastik, plastik wrapp, kertas koran steril, selotip, oven. Sebelum dilakukan fermentasi, kapang Trichoderma reesei diukur karakteristik pertumbuhan kapang yang meliputi jumlah koloni, diameter koloni dan persentase perubahannya. Hal ini menjadi dasar dalam penentuan waktu yang tepat dalam menginokulasi kapang untuk perbanyakan. Perbanyakan inokulum kapang dan fermentasi BIS dilakukan di Laboratorium Biokimia, Fisiologi dan Mikrobiologi Nutrisi selama 4 bulan. Pemotretan BISF dengan alat Scanning Microscope Electron SEM dilakukan di Laboratorium Pemuliaan dan Genetika Ternak.

C. Rancangan Percobaan

Analisis regresi digunakan untuk melihat kurva pertumbuhan kapang yang meliputi jumlah koloni dan diameter koloni. Umur pertumbuhan kapang yang diamati : 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, dan 72 jam. Model matematis rancangan penelitian adalah : Y = ax1 + bx2 Keterangan : Y = kombinasi linier dari x1 dan x2 a dan b adalah konstanta x1 dan x2 adalah variabel bebas Uji dosis kapang dan ketebalan media BIS menggunakan Rancangan Acak Lengkap RAL pola Faktorial dengan faktor pertama konsentrasi kapang, dan faktor kedua ketebalan media BIS, dengan ulangan sebanyak 3 kali. Faktor pertama konsentrasi kapang : D4 = konsentrasi kapang 10 4 CFUcc D5 = konsentrasi kapang 10 5 CFUcc D6 = konsentrasi kapang 10 6 CFUcc Faktor kedua ketebalan media BIS : S1 = ketebalan media 1 cm S2 = ketebalan media 2 cm S3 = ketebalan media 3 cm Model matematis rancangan penelitian adalah : 38 Y ijk = μ + α i + βj + α i βj + ε ijk Keterangan : Y ijk = nilai pengamatan satuan percobaan ke-k yang mendapat kombinasi perlakuan taraf ke-i dari konsentrasi kapang dan taraf ke-j dari faktor ketebalan media μ = nilai rataan umum α I = pengaruh taraf ke-i dari faktor konsentrasi kapang βj = pengaruh taraf ke-j dari faktor ketebalan media α i βj = pengaruh interaksi taraf ke-i i = 1, 2, 3 dari faktor konsentrasi kapang dan taraf ke-j j = 1, 2, 3 dari faktor ketebalan media ε ijk = pengaruh galat dari satuan percobaan ke-k k = 1, 2, 3 yang memperoleh kombinasi perlakuan ij

D. Peubah yang Diukur

1. Jumlah koloni kapang Pelczar Reid 1972. Sebelum melakukan perhitungan koloni terlebih dahulu dibuat media Potatoe Dextrose Agar PDA. Sebanyak 3.9 gram PDA dilarutkan dalam 100 cc air aquades steril kemudian diaduk hingga rata. Larutan tersebut dipanaskan hingga seluruhnya larut. Media PDA tersebut dituangkan pada tabung reaksi sebanyak 3-4 cc yang ditutup kapas kemudian disterilkan pada suhu 121 o C selama 15 menit di dalam autoclave. Setelah dingin pada suhu 45 – 50 o C, medium yang masih cair ditempatkan dalam keadan miring dengan kemiringan 30 o dan media PDA tidak mengenai kapas. Biakan murni kapang Trichoderma reesei ditanam pada media agar miring di dalam laminair, kemudian disimpan pada suhu kamar 28 o C, diinkubasi selama 48 – 72 jam. Setelah 72 jam Inokulum berupa spora ditambahkan aquades steril sebanyak 10 ml per tabung reaksi, kemudian spora dipiisahkan dengan cara permukan biakan yang berisi biakan kapang pada agar miring digores-gores dengan menggunakan pengaduk mika, selanjutnya di vortex agar suspensi spora menjadi homogen dan siap dilakukan perhitungan jumlah koloni. Pada perhitungan jumlah koloni dipersiapkan media PDA yang sudah steril sama seperti diatas hanya saja tempatnya pada cawan petri. Sederetan tabung reaksi yang berisi 9.9 ml aquades steril dipersiapkan sebanyak 5 tabung dan diberi label mulai dari pengenceran 10 -2 sampai 10 -6 . 0.1 ml larutan spora dimasukan kedalam tabung 10 -2 , kemudian dari tabung tersebut diambil 0,1 ml untuk dituangkan pada tabung 10 -3 dan satu lagi dimasukan dalam cawan petri dan demikian seterusnya. Sebelum pengambilan larutan spora dalam 39 tabung harus dihomogenkan dengan vortex. Cawan petri disimpan pada suhu kamar 28 o C, dan diinkubasi selama 48 – 72 jam. Lakukan pengamatan setiap 6 jam untuk perhitungan jumlah koloni. 1 Jumlah koloni ml = jumlah koloni dalam cawan petri X pengenceran 2. Perubahan diameter koloni kapang Santiago et al. 2006. Persiapan pengukuran diameter koloni kapang hampir sama dengan perhitungan jumlah koloni. Media PDA yang sudah steril ditempatkan dalam cawan petri. Bagian bawah cawan petri dibuat garis vertikal dan horizontal tepat ditengah cawan petri. Hal ini untuk memudahkan dalam pengukuran maupun penempatan spora kapang. Osse yang sudah steril dicelupkan pada larutan spora dan ditusukan pada media PDA tepat dipersilangan garis vertikal dan horisontal. Pengamatan diameter pertumbuhan kapang dilakukan setiap 6 jam. Perubahan Diameter Koloni = A – B x 100 A Keterangan : A = diameter koloni saat pengamatan B = diameter koloni saat pengamatan sebelumnya 3. Suhu media selama fermentasi. Media BIS yang difermentasi diukur suhunya setiap 24 jam. 4. pH media selama fermentasi. Media BIS yang difermentasi pada waktu tertentu diambil kemudian digerus dengan mortar dan ditambahkan aquades dengan perbandingan 1 : 5. pH diukur saat angka tidak berubah lagi. 5. Kandungan Bahan Kering Metoda Weende. Diukur dengan cara bahan yang ditempatkan dalam cawan khusus dioven pada suhu 105 o C selama 24 jam. Kandungan bahan kering dihitung sebagai selisih antara 100 dengan persentase air 6. Kandungan Protein Kasar Metoda Kjeldahl. Analisis ini menggunakan asam sulfat dengan suatu katalisator dan pemanasan. Zat organik dari sampel dioksidasi oleh asam sulfat dan nitrogen diubah kedalam ammonium sulfat. Kelebihan asam sulfat dinetralisis dengan NaOH sampai larutan menjadi basa. Dari ammonium sulfat lalu didestilasi dalam medium asam untuk 40 Gambar 9 Skema fermentasi BIS oleh kapang Trichoderma reesei mendapatkan nitrogen secara kuantitatif. Karena protein rata-rata mengandung 16 Nitrogen, maka 100 : 16 = 6.25 harus dipakai untuk mendapatkan nilai protein kasar Protein kasar = N x 6.25 7. Kandungan NDF Metoda Van Soest Robertson 1968 . Diukur dengan cara melarutkan bahan pakan dengan Neutral detergen soluble NDS. Bagian yang tidak larut dinyatakan sebagai dinding sel atau Neutral detergen fiber NDF 8. Kandungan ADF Metoda Van Soest Robertson 1968 . Diukur dengan cara dinding sel NDF dilarutkan kembali dengan larutan asam. Bagian yang tidak larut dalam larutan asam tadi dinyatakan sebagai Acid detergen fiber ADF. 9. Kandungan Hemiselulosa Metoda Van Soest Robertson 1968 . Dihitung dengan cara kandungan NDF dikurangi dengan kandungan ADF diperoleh hemiselulosa. Pengayakan BIS Saringan 2 mm Autoklaf 121 o C selama 15 menit Penambahan Nutrient Media NH 4 NO 3 0.5 KCl 0.05 MgSO 4 .7H 2 O 0.05 FeSO 4 .7H 2 O 0.01 CuSO 4 .7H 2 O 0.0001 Pemanenan Inkubasi suhu Ruang 28 o C Selama 96 jam Penambahan Inokulum kapang Trichoderma reesei Konsentrasi 2.13x10 6 CFUcc Dosis 1 cc100 g BIS Pengeringan Oven 50 o C selama 24 jam Penggilingan Penyimpanan 41 10. Penampakan visual pertumbuhan kapang. Dilihat penampakan media BIS selama fermentasi oleh kapang Trichoderma reesei setiap 24 jam dan dibandingkan perubahan setiap perlakuan.

E. Analisis Statistik