j. Amil alkohol k. Etanol 70
l. FeCl
3
5 m. Pereaksi Molisch
n. Pereaksi Benedict o. Pereaksi Biuret
p. Ninhidrin 0,1
3. Uji aktivitas antimalaria secara
invitro a. Inkubator BINDER
b. Membran milipore corning c. Tabung sentrifugasi corning
ukuran 10 mL,15 mL dan 50 mL
d. Ruang LAF ESCO e. Alat Sentrifugasi Digisystem
Lab. Instruments, Inc. f. Cawan diameter 50 mm
g. Piper Pasteur h. Pipet micro
i. Esikator j. Kompresor
k. Magnetic stirrer Cimarec l. Erlenmeyer
m. Gelas piala n. Mikroskop
o. Slide mikroskop a. Ekstrak teripang
b. Arterakin c. Kuinin
d. P. falcifarum e. RPMI 1640
f. HEPES g. NaHCO
3
5 h. Antibiotik gentamisin
sulfat injeksi i. NaCl 3,5
j. Sorbitol 5 k. Serum dan sel darah
merah manusia l. Antikoagulan sitrat
fosfat dektrosa CPD m. Pewarna giemsa
n. Akuabidestilata o. Larutan buffer fosfat
pH 7,2 p. Alkohol 70
q. Metanol
3.3 Tahapan Penelitian
Penelitian ini dilakukan dengan tiga tahap yaitu preparasi dan ekstraksi, analisis fitokimia, dan pengujian aktivitas antimalaria in vitro. Diagram alir
penelitian dapat dilihat pada Gambar 5.
3.3.1 Preparasi dan ekstraksi
Penelitian ini diawali dengan pengambilan dan preparasi sampel serta persiapan bahan dan alat untuk ekstraksi senyawa aktif. Sampel teripang keling
Holothuria atra diambil di perairan Kepulauan Seribu, Jakarta. Preparasi teripang dilakukan dengan cara memisahkan jeroan dengan daging. Daging yang
didapatkan dipotong-potong menjadi bagian kecil untuk memudahkan proses selanjutnya. Sebelum dilakukan ekstraksi, bahan baku teripang terlebih dahulu
dikeringkan. Pengeringan dilakukan dengan freeze dryer bersuhu -50
o
C.
Pengeringan dengan suhu rendah digunakan untuk mempertahankan komponen aktif yang terdapat dalam teripang. Yuan et. al 2011 menjelaskan bahwa suhu
tinggi dapat menyebabkan kerusakan komponen bioaktif. Setelah kering, teripang dihaluskan dengan hammer mills.
Gambar 5. Diagram alir penelitian Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi menggunakan shaker selama
24 jam. Maserasi dilakukan secara bertingkat dan tunggal. Pelarut yang digunakan dalam maserasi bertingkat adalah metanol, etil asetat dan heksana.
Preparasi sampel
Ekstraksi maserasi
Ekstraksi tunggal dengan metanol
Ekstraksi bertingkat n-heksana, etil asetat, metanol
Uji fitokimia Uji aktivitas
antimalaria in vitro Freeze drying
Penepungan Thawing
Pembekuan Pengambilan sampel
Ekstrak kasar
Gambar 6. Diagram alir ekstraksi bertingkat Serbuk teripang
Penimbangan 50 gr
Maserasi 24 jam x 3 dengan n-heksana
Penyaringan kertas Whatman 42
Maserasi 24 jam x 3 dengan etil asetat
Penyaringan kertas Whatman 42
Maserasi 24 jam x 3 dengan metanol
Penyaringan kertas Whatman 42
Filtrat 1
Residu Residu
Residu
Evaporasi
Ekstrak n-heksana
Filtrat 2
Evaporasi
Ekstrak etil asetat
Filtrat 3
Evaporasi
Ekstrak metanol
Gambar 7. Diagram alir ekstraksi tunggal
3.3.2 Analisis fitokimia
Analisis fitokimia dilakukan untuk menentukan komponen bioaktif yang terdapat pada ekstrak kasar teripang keling. Uji fitokimia dapat mendeteksi
komponen bioaktif pada metabolit primer yang memberikan aktivitas biologis fungsional seperti protein dan peptida Kannan et al. 2009. Identifikasi senyawa
yang terkandung dalam teripang dilakukan dengan cara sebagai berikut: a Senyawa Alkaloid
Ekstrak kasar dari masing-masing pelarut diambil sebanyak 1 mg dengan ujung sudip, selanjutnya
dilarutkan dalam beberapa tetes asam sulfat 2 N kemudian diuji dengan tiga pereaksi alkaloid, yaitu pereaksi Dragendorff, Meyer
dan Wagner. Hasil uji dinyatakan positif bila dengan pereaksi Meyer terbentuk endapan putih kekuningan, dengan pereaksi Wagner membentuk endapan coklat
dan dengan pereaksi Dragendorff membentuk endapan merah sampai jingga. Serbuk teripang
Penimbangan 50 gr Maserasi 24 jam x 3 dengan metanol
Penyaringan kertas Whatman 42
Filtrat Residu
Evaporasi
Ekstrak metanol tunggal
Pereaksi Meyer dibuat dengan cara menambahkan 1,36 HgCl
2
dengan 0,5 gram kalium iodida lalu dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 100 mL
dalam labu takar. Pereaksi Wagner dibuat dengan cara 10 mL akuades dipipet kemudian ditambahkan 2,5 gram iodin dan 2 gram kalium iodida, kemudian
dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 200 mL dalam labu takar. Pereaksi ini berwarna coklat. Pereaksi Dragendorff dibuat dengan cara 0,8 gram
bismut subnitrat ditambahkan dengan 10 mL asam asetat dan 40 mL air. Larutan ini dicampur dengan larutan yang dibuat dari 8 gram kalium iodida dalam 20 mL
air. Sebelum digunakan, 1 volume campuran ini diencerkan dengan 2,3 volume campuran 20 mL asam asetat glasial dan 100 mL air.
b Senyawa Steroid Ekstrak kasar dari masing-masing pelarut diambil sebanyak 1 mg. Kemudian
dilarutkan dalam 2 mL kloroform dalam tabung reaksi. Anhidrida asetat sebanyak 10 tetes dan asam sulfat pekat sebanyak 3 tetes ditambahkan ke dalam campuran
tersebut. Hasil uji positif contoh mengandung steroid yaitu terbentuknya larutan berwarna merah untuk pertama kali kemudian berubah menjadi biru dan hijau.
c Senyawa Saponin Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Busa yang stabil
selama 30 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2 N menunjukkan contoh mengandung saponin.
d Flavonoid Ekstrak kasar dari masing-masing pelarut diambil sebanyak 1 mg.
Kemudian ditambah serbuk magnesium 0,1 mg dan 0,4 mL amil alkohol campuran asam
klorida 37 dan etanol 95 dengan volume sama dan 4 mL alkohol, kemudian campuran dikocok. Hasil uji positif contoh mengandung flavonoid, yaitu
terbentuknya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol. e Fenol hidrokuinon
Sebanyak 1 mg contoh diekstrak dengan 20 mL etanol 70. Larutan yang dihasilkan diambil sebanyak 1 mL kemudian ditambahkan 2 tetes larutan FeCl
3
5. Hasil uji positif contoh mengandung senyawa fenol, yaitu terbentukya larutan berwarna hijau atau hijau biru.
f Ninhidrin Kandungan asam amino Larutan contoh sebanyak 2 mL ditambahkan beberapa tetes larutan ninhidrin
0,1. Campuran dipanaskan dalam penangas air selama 10 menit. Hasil uji positif contoh mengandung asam amino, yaitu terbentuknya larutan berwarna biru.
3.3.3 Uji antimalaria in vitro
