f Ninhidrin Kandungan asam amino Larutan contoh sebanyak 2 mL ditambahkan beberapa tetes larutan ninhidrin
0,1. Campuran dipanaskan dalam penangas air selama 10 menit. Hasil uji positif contoh mengandung asam amino, yaitu terbentuknya larutan berwarna biru.
3.3.3 Uji antimalaria in vitro
Uji aktivitas antimalaria dilakukan secara in vitro dan berdasarkan metode Desjardins et al. 1979 dalam
O’Neill et al. 1985. Sebelum dilakukan uji efektifitas ekstrak teripang, terlebih dahulu, dilakukan pengembangbiakan parasit
secara berkesinambungan dengan metode candle jar yang dikembangkan oleh Trager dan Jensen. Kegiatan dimulai dengan pembuatan media media Roswell
Park RP, NaHCO
3
5, media transport dan sorbitol untuk sinkronisasi, serum darah, eritrosit dari golongan darah O dan biakan stock Plasmodium falciparum
Purwantiningsih 2003; WHO 2008
1 Kultur Plasmodium falciparum Purwantiningsih 2003
Tahapan kultur Plasmodium falciparum memerlukan media tumbuh yang dipersiapkan secara aseptis. Media tumbuh dibuat secara aseptis dalam ruang
steril Laminar air flow dengan menggunaan alat-alat yang telah disterilisasi terlebih dahulu sesuai prosedur. Persiapan yang diperlukan adalah sebagai berikut.
1 Penyiapan media biakan a. Medium dasar Roswell Park Memorial Institute RPMI 1640
Media ini dibuat dengan melarutkan 10,4 gr RPMI 1640 yang mengandung L-glutamin dalam 960 mL akuabidestilata steril dalam gelas
piala berukuran 1000 mL. Selanjutnya ke dalam larutan tersebut ditambahkan 5,94 gr asam N-2-hidroksi etil piperazin-N-2-etana sulfonat HEPES sambil
diaduk dengan pengaduk magnet sampai larutan homogen. Larutan berubah warna dari jingga tua ke jingga. Setelah larutan homogen, ditambahkan
antibiotik gentamisin sulfat sebanyak 50 mg dan larutan diaduk kembali. Larutan disterilkan dengan cara filtrasi melalui membran milipore yang
berdiameter 0,22 μM. Media ini ditempatkan dalam botol-botol reagen steril berukuran 100 mL dan disimpan pada suhu 4
⁰C. Media dapat digunakan selama satu bulan.
b. Larutan NaHCO
3
5 bv Larutan dibuat dengan cara melarutkan 5 gram NaHCO
3
dalam 100 mL akuabidestilat. Larutan disterilisasi dengan cara filtrasi melalui membran
milipore yang berdiameter 0,22 μm. Larutan ini ditempatkan dlaam botol reagen steril 100 mL dan disimpan pada suhu 4
⁰C. c. Medium transpor
Media ini dibuat dengan cara mencampurkan 100 mL larutan media dasar RPMI 1640 dengan 4,2 mL larutan NaHCO
3
5 bv. Larutan disterilisasi dengan cara filtrasi melalui membran
milipore yang berdiameter 0,22 μm. Media ini ditempatkan dalam botol reagen steril 100 mL dan disimpan pada
suhu 4 ⁰C.
d. Serum segar Serum yang digunakan adalah serum manusia dari golongan darah A. Cara
mendapatkan serum adalah sebagai berikut: darah diambil melalui pembuluh vena dengan alat suntik steril sebanyak 100 mL darah dimasukkan ke dalam
tabung sentrifusi steril dan disimpan dengan cara dimiringkan pada incubator suhu 37
⁰C selama 1 jam. Selanjutnya darah disimpan pada suhu 4⁰C semalam over night. Serum dipisahkan dari bekuan darah dengan cara
sentrifugasi pada kecepatan putar 1500 rpm selama 15 menit. Serum dipisahkan dengan pipet Pasteur steril dan dimasukkan dalam tabung steril
kemudian disimpan pada suhu -20 ⁰C.
e. Medium lengkap Media ini dibuat dengan cara mencampurkan 100 mL larutan media dasar
100 mL larutan media dasar RPMI 1640 dengan 4,2 mL larutan NaHCO
3
5 bv dan 11,5 mL. Selanjutnya media disterilisasi dengan cara filtrasi melalui
m embran milipore yang berdiameter 0,45 μm. Media ini disimpan pada suhu
4 ⁰C.
2 Penyiapan sel darah merah a. Sel darah merah normal
Darah golongan O diambil melalui pembuluh vena sebanyak 10 mL dan dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi yang telah berisi 1,4 mL larutan zat
anti koagulan Citrat Phosphat Dextrose CPD. Larutan digoyang sampai
homogen, selanjutnya larutan disentrifugasi dengan kecepatan 1500 rpm selama 15 menit pada suhu kamar. Supernatan plasma dibuang dengan
menggunakan pipet Pasteur, endapan atau packed cell yang tertinggal dicuci dengan media transpor sebanyak dua kali. Sebelum disentrifugasi, packed cell
dan media transpor dihomogenkan secara perlahan. Sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 1500 rpm selamam 15 menit dan supernatan dibuang. Packed
cell yang telah dicuci disuspensikan ke dalam media RPHS dengan perbandingan volume 1:1, sehingga didapatkan suspensi yang mengandung
50 eritrosit dan disebut dengan stock Red Blood Cell RBC 50. Suspensi ini disimpan pada suhu 4
⁰C dan setiap seminggu sekali diperlukan penggantian media RPHS.
b. Biakan P. falciparum Biakan P. falciparum diambil dari deep freezer dan dicairkan. Cairan
dipindahkan ke dalam tabung sentrifusi, dicuci dengan larutan NaCl 3,5 dengan perbandingan volume 1:1 sambil diaduk perlahan. Selanjutnya larutan
disentrifugasi dengan kecepatan putar 1500 rpm selama 15 menit dan pencucian dilakukan sebanyak dua kali. Setelah supernatant dibuang dengan
pipet Pasteur steril, packed cell dicuci dengan serum steril dengan perbandingan volume 1:1. Selanjutnya, packed cell dicuci sebanyak dua kali
menggunakan media transpor dan siap untuk dibiakkan. 3 Pengembangbiakan parasit P. falciparum
Biakan parasit disuspensikan dengan eritrosit normal dan diberi media lengkap RPHS Roswell Park Human Serum sehingga diperoleh angka 4
hematokrit. Susupensi ini dimasukkan ke dalam cawan petri berdiameter 50 mm masing-masing sebanyak 4 mL. Biakan dimasukkan ke dalam candle jar
desikator dan diberi lilin bernyala sehingga didapatkan dengan kondisi gas O
2
3, CO
2
4, dan N
2
93. Untuk mendapatkan kondisi tersebut caranya, di dalam eksikator yang telah berisis cawan-cawan biakan diletakkan lilin
yang menyala. Desikator ditutup dan bagian tepi dibiarkan sedikit terbuka. Bila nyala lilin hampir padam, desikator ditutup rapat sehingga desikator
menjadi kedap udara dengan cara melapis mulut desikator dengan silika gel
atau vaselin. Selanjutnya candle jar diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37
⁰C. Setiap 24 jam media RPHS diganti dengan media RPHS yang baru. Cara menggantikan media kultur adalah: cawan petri dikeluarkan dari
candle jar, dimiringkan dalam ruang steril laminar air flow selama 10 menit. Cairan diambil dengan pipet Pasteur steril secara hati-hati agar sel parasit
tidak terganggu. Sebelum ditambah media, packed cell diambil satu sampai dua tetes untuk membuat sediaan darah tipis dan tebal pada slide mikroskop.
Pembuatan sediaan darah tebal berguna untuk melihat perkembangan parasit dan menghitung angka parasitemia. Kemuadian, cawan petri diletakkan
mendatar dan ke dalammnya ditambahkan media RPHS baru sebanyak 3,5 mL. Cawan digoyang perlahan agar suspensi parasit menjadi homogen
kambali. Cawan diletakkan dalam candle jar dan diinkubasi dalam inkubator. Penyiapan kultur P. falciparum untuk uji antimalaria dapat dilihat pada
Gambar 8.
Gambar 8. Diagram alir kultur P. falciparum Pencampuran homogen
Stock biakan P. falciparum diambil dari deep freezer -80
o
C Thawing
Sentrifugasi 1800 rpm, 10 menit Penambahan RBC stock PVC 50
Kultivasi dalam cawan kultur
P.falciparum siap uji
2 Perencanaan konsentrasi
Konsentrasi yang digunakan pada penelitian ini merupakan konsentrasi dengan kelipatan dua dari 10-2560
μgmL. Rancangan konsentrasi senyawa uji dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Perencanaan konsentrasi ekstrak teripang pada uji secara in vitro No
Sampel K
onsentrasi μgmL 1
2 3
4 5
6 7
8 9
1. Ekstrak n-heksana 10 20 40 80 160 320 640 1280 2560
2. Ekstrak etil asetat
10 20 40 80 160 320 640 1280 2560 3.
Ekstrak metanol A 10 20 40 80 160 320 640 1280 2560 4.
Ekstrak metanol B 10 20 40 80 160 320 640 1280 2560
Keterangan : A : ekstraksi bertingkat B : ekstraksi tunggal
3 Penyiapan micro plate 96 well WHO 2008
Micro plate 96 well steril dipersiapkan. Kolom 1 sebagai kontrol positif 1 diisi dengan larutan arterakin konsentrasi 167,804
μgmL. Kolom 2 sebagai kontrol positif 2 diisi dengan larutan kuinin konsentrasi 28
μgmL. Kolom 3 digunakan sebagai kontrol negatif. Larutan ekstrak teripang diisikan ke dalam
sumur masing-masing 25 μL dengan rincian sebagai berikut:
- Baris A dan B kolom 4 – 12 diisi dengan ekstrak heksana masing-masing
dengan konsentrasi 1 - 9 - Baris C dan D kolom 4
– 12 diisi dengan ekstrak etil asetat masing-masing dengan konsentrasi 1 - 9
- Baris E dan F kolom 4 – 12 diisi dengan ekstrak metanol bertingkat
masing-masing dengan konsentrasi 1 – 9
- Baris G dan H kolom 4 – 12 diisi dengan ekstrak metanol tunggal masing-
masing dengan konsentrasi 1 - 9 Penyiapan mikrco plate 96 well dapat dilihat pada Gambar 9. Selanjutnya
sebanyak 200 μL suspensi parasit dengan angka parasitemia 0,7 dimasukkan ke
dalam tiap sumur. Micro plate ditutup dan digoyang perlahan supaya bahan uji menyatu dengan suspensi parasit. Selanjutnya micro plate dimasukkan deksikator
berisi lilin candle jar dan diinkubasi pada suhu 37 ⁰C selama 24 jam.
Gambar 9. Diagram alir penyiapan micro plate 96 well
4 Memeriksa hasil uji
O’Neill 1986
Proses pengujian antimalaria dapat dilihat pada Gambar 10. Setelah inkubasi selama 24 jam, biakan P. falciparum dikeluarkan dan dibuat preparat hapusan
darah. Pembuatan preparat darah dilakukan dengan meneteskan 1 tetes sampel ke atas gelas obyek, kemudian dibuat sediaan apus tipis dan tebal, sampel dibiarkan
sampai kering selama satu malam. Sediaan darah tipis dilakukan fiksasi dengan metanol selama 1 detik, kemudian diwarnai dengan larutan Giemsa secara
standar 3 selama 45 menit dan dibilas dengan menggunakan air mengalir.
Gambar 10. Diagram alir uji aktivitas antimalaria Pemeriksaan hasil uji
dibuat slide hapusan darah Micro plate 96 well yang
sudah diisi ekstrak 200
μgmL sel parasit dimasukkan dalam micro plate 96 well
Inkubasi 37
o
C, 24 jam Micro plate siap uji
Ekstrak teripang disiapkan dalam berbagai konsentrasi
Ekstrak dimasukkan dalam micro plate dengan pipet Eppendorf
Disimpan dalam refrigerator
Sediaan darah diperiksa di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000 kali menggunakan minyak immersi. Pembacaan diawali pada sediaan darah tebal
untuk melihat perkembangan pertumbuhan parasit secara keseluruhan. Persen penghambatan inhibisi senyawa uji terhadap pertumbuhan parasit
dihitung dengan cara membandingkan dengan kontrol negatif dihitung menggunakan rumus:
Parasitemia = Eritrosit yang terinfeksi
x 100 5000 eritrosit
Inhibisi = 100 - Parasitemia uji
x 100 Parasitemia kontrol
3.3.4 Analisis Data
