Bahan Penelitian Seleksi Cendawan Potensial Penghasil Enzim Endoglukanase (Karboksimetil Selulase) dan Isolasi Gen Penyandinya
Pengukuran kadar protein total dilakukan dengan metode Lowry Ghose, 1987. Sebanyak 0.5 ml ekstrak kasar enzim dimasukkan kedalam tabung reaksi
dan setelah itu ditambahkan 5 ml reagen C. Reagen C dibuat dengan mencampur 100 ml reagen A Na
2
CO
3
2 bv dalam NaOH 0.1N dan 2 ml reagen B CuSO
4
.5H
2
O 0.5 bv dalam K Tartarat 1 bv. Tabung kemudian divorteks dan didiamkan pada suhu kamar selama 10 menit. Setelah itu, ke dalam
tabung dimasukkan 0.5 ml Reagen D reagen folin Ciocalteau yang telah diencerkan dengan air sampai 1N. Tabung kemudian divorteks dan didiamkan
pada suhu kamar selama 30 menit. Nilai rapat optis O.D setiap isi tabung dibaca dengan menggunakan spektrofotometer pada λ750 nm terhadap blanko. Hasil
pengukuran kemudian dimasukkan ke dalam persamaan kurva standar bovine serum albumin
BSA yang telah dibuat untuk mengukur kadar protein Lampiran 1. Selanjutnya aktivitas spesifik enzim dapat ditentukan berdasarkan unitml
aktivitas enzim dan kadar protein yang didapat dengan rumus sebagai berikut.
mgml protein
kadar unitml
unit aktivitas
unitmg spesifik
aktivitas =
3.3.3 Isolasi gen penyandi endoglukanase A. niger IPB1 3.3.3.1 Isolasi RNA total
Isolasi asam ribonukleat RNA total A. niger IPB1 dilakukan pada biakan yang berumur 3 hari. Miselium dari biakan A. niger IPB1 yang ditumbuhkan pada
media cair dipanen. Sebanyak 1 g miselium digerus dengan bantuan nitrogen cair dalam mortal sampai terbentuk bubuk halus, kemudian diekstrak dengan 800 l
reagen TRIzol Invitrogen. Inkubasi dilakukan selama 5 menit pada suhu ruang, selanjutnya ditambahkan 200 l kloroform, dibolak-balik selama 30 detik.
Campuran diinkubasi selama 3 menit pada suhu ruang, selanjutnya disentrifugasi pada 9000 rpm Jouan BR4i selama 15 menit pada suhu 6
o
C. Supernatan yang diperoleh dipindahkan ke dalam tabung baru dan ditambahkan 500 l isopropil
alkohol, kemudian diinkubasikan selama 10 menit pada suhu ruang dan disentrifugasi pada 9000 rpm Jouan BR4i selama 10 menit pada suhu 6
o
C. Supernatan dibuang dan endapannya dicuci dengan etanol 75 vv dan