Analisis situs pemotongan gen eglA Analisis domain EglA

dari Aspergillus terreus E-value 6.9e-113 dan 75 dengan endoglukanase atau cel A dari Aspergillus oryzae E-value 4.8e-105 Lampiran 5 dan 6. BLAST merupakan program pencari similaritas suatu urutan nukleotida atau asam amino dengan database yang berbasis local alignment, yaitu penyejajaran pada suatu segmen sekuen yang lebih pendek dengan derajat similaritas yang sangat tinggi. Similaritas mengindikasikan homologi suatu gen atau protein. Jika kedua urutan gen atau protein homolog maka dapat dikatakan bahwa keduanya mempunyai leluhur, fungsi dan struktur yang sama. Dua gen atau fragmen DNA dikatakan homolog jika 70 urutan nukleotidanya atau 25 urutan asam aminonya identik panjang urutan minimal 100 Claviere Notredame 2003. Berdasarkan hal diatas maka dapat dipastikan bahwa eglA merupakan gen egl A dari Aspergillus niger. Gambar 14 Peta situs pemotongan eglA dengan menggunakan program NEBcutter

4.3.3 Analisis situs pemotongan gen eglA

Analisis situs pemotongan enzim restriksi endoglukanase digunakan untuk membuat peta situs pemotongan enzim restriksi peta restriksi pada suatu gen atau fragmen DNA. Peta restriksi ini bermanfaat dalam menentukan enzim-enzim restriksi apa saja yang dapat digunakan dalam kegiatan manipulasi suatu gen atau fragmen DNA. Pada analisis peta pemotongan gen eglA terlihat tidak terdapat situs pemotongan EcoRI yang digunakan untuk mengeluarkan DNA sisipan dari plasmid pGEM-T Easy sebagai vektornya Gambar 14. Hasil ini sekaligus dapat digunakan untuk verifikasi keberhasilan pengklonan gen eglA pada plasmid pGEM-T Easy. Selain itu terdapat beberapa situs pemotongan yang terdapat pada gen eglA dan situs pengklonan MCS pGEM-T Easy, seperti ApaI, NcoI, PstI dan NsiI, sehingga enzim-enzim ini tidak dapat digunakan untuk mengeluarkan DNA sisipan dari plasmid, karena akan memotong DNA sisipan juga Gambar 14. Gambar 15 Perbandingan domain EglA dari berbagai organisme berdasarkan database pfam

4.3.4 Analisis domain EglA

Analisis domain EglA dilakukan menggunakan program Pfscan berdasarkan database Pfam. EglA memiliki katalitik domain yang termasuk dalam A. niger Glyco hydro 12: 82-239 T. reesei Glyco hydro 12: 81-234 S. lividans Glyco hydro 12: 111-261; CBM 2 : 279-378 B. licheniformis Glyco hydro 12: 104-261 kelompok Glikosida hidrolase famili 12 GH12 pada posisi asam amino ke-82 sampai asam amino ke-239 Gambar 15. Arsitektur EglA A. niger ini sama dengan arsitektur beberapa anggota famili GH12 lainnya, seperti Cel12A T. reesei dan Cel12A B. Licheniformis. Arsitektur jenis ini hanya mengandung katalitik domain dan tidak mengandung carbohydrate binding moduls CBM. Secara umum, kelompok glikosida hidrolase terdiri dari dua domain utama, yaitu katalitik domain dan carbohydrate binding moduls CBM yang dihubungkan oleh suatu linker yang kaya akan prolin Gambar 16. Posisi domain katalitik maupun domain CBM dapat terdapat pada C-terminal maupun N- terminal. Posisi ini tidak menentukan spesifisitas suatu enzim Gilkes et al. 1991. Peran domain CBM pada enzim sampai saat ini masih belum jelas. Namun demikian Hashimoto 2006 menyatakan peran utama CBM meningkatkan efisiensi fungsi katalisis enzim-enzim karbohidrase walaupun dengan mekanisme yang belum jelas. linker Gambar 16 Domain umum selulase yang terdiri dari domain katalitik dan CBM yang dihubungkan oleh daerah penghubung linker GH12 merupakan salah satu famili glikosida hidrolase yang mempunyai aktivitas endoglukanase dan xyloglukan hidrolase. Mekanisme katalisisnya adalah retaining dengan Glutamat Glu sebagai basa nukleofil maupun donor protonnya. Sampai saat ini GH12 mempunyai sekitar 151 anggota dengan 7 arsitektur yang berbeda. Sebagian besar anggota mempunyai arsitektur tanpa domain CBM. Sementara itu arsitektur dengan kombinasi antara katalitik domain dan domain CBM, seperti pada Cel2B S. lividans hanya sedikit. Berdasarkan perbandingan struktur homolog dengan struktur endoglukanase lain yang sudah diketahui, residu-residu yang berperan dalam fungsi katalitik EglA A.niger IPB1 maupun pengikatan substratnya dapat dideduksikan Gambar 17. Glu116 diprediksi berperan sebagai nukleofil dan Glu204 diprediksi berperan sebagai donor proton. Pada famili GH12, posisi Catalytic domain CBM nukleofil ini berdekatan dengan dua residu yang sangat terkonservasi, yaitu Asp99 dan Met118 Zechel et al. 1998; Sandgreen et al. 2003. Situs pengikatan glikosil diprediksikan tersusun atas beberapa residu dengan rantai samping aromatik, seperti Trp, Tyr dan Phe Sandgreen et al. 2003. Mengacu pada beberapa residu yang terlibat dalam pengikatan substrat pada famili GH 12 Goegedebuur et al 2002, residu Trp posisi 22, 49, 51, 85, 120, 144, Tyr 61, 98, 115 dan Phe 163, 179 pada A. niger IPB1 diprediksi berperan dalam pengikatan substrat glikosil. Gambar 17 Kesejajaran urutan asam amino empat enzim GH 12. Posisi residu nukleofil dan donor proton ditunjukkan dengan tanda anak panah hitam dan putih secara berturut-turut. 4.3.5 Analisis hidrofobisitas EglA Analisis hidrofobisitas dilakukan untuk mengetahui profil hidrofobisitas dari suatu urutan asam amino. Analisis ini digunakan untuk untuk menentukan apakah suatu protein termasuk protein yang larut dalam air atau protein membran Zhao London 2006. Profil hidrofobisitas berdasarkan skala Kyte Doolittle menunjukkan secara keseluruhan EglA mempunyai nilai hidrofobisitas yang 1 10 20 30 40 50 | | | | | | A.niger GQ-TMCSQYDSAS-SPP Y SVNQ N L WG EYQGTGS-QCVYVNKLSSSGASWHTEWTWSGGEG B.licheniformis S S - S N P S DKLYF K -NKK Y YIF N N V WG ADQ VS GWWQ T IYH N --SDS D MGW--VWNW P S N TS T.reesei A Q - T S C D QWATF T -GNG Y TVS N N L WG ASA GS GF-G C VTA V SL-SG G ASWHADWQW S G G QN S.lividans A D T T I C E PFGTT T IQGR Y VVQ N N R WG --- ST AP-Q C VTA T DTGFR V TQADGSAPT N G A PK 60 70 80 90 100 | | | | | A.niger TVKSYSN------------SGVTF-NKKLVSDVSSIPTSVEWKQDNTNVNADVA YD LFTA B.licheniformis T VKAYPSIVSGWHWTEGYT A GS G F-PTRL- SD Q K N I NT K V S YSI- SAN GTY NA A YD IWLH T.reesei N VKSYQN------------ S QI A IPQKRTV NS I S S M PT T A S WSYS GSN IRA NV A YD LFTA S.lividans S YPS---VFNGCHYTN--- C SP G TDLPVRL DT V S A A PS S I S YGFV DGA V-Y NA S YD IWLD 110 120 130 140 150 160 | | | | | | A.niger ANVDHAT--SSGDY E L MIW LARYGNIQ P I G KQIA T ATV GG KS W EVWY G STTQAGAE-QRT B.licheniformis - NT NK A SWDS AP T D E I MIW L N N T- N AG P A G S YVE T VS I GG H S W K VYK G YIDAGGGKGW N V T.reesei A NP NH V T--Y SG D Y E L MIW L G K YG D IG P I G S SQG T VN V GG Q S W T LYY G YN----GA-M Q V S.lividans P TA -R T --DG VN Q T E I MIW F N R VG P IQ P I G S PVG T AS V GG R T W E VWS G GN----GS-N D V 170 180 190 200 210 | | | | | A.niger Y SF VSESPINSYSGAINA F FSYLTQNQGFPASSQ Y LINLQF G T E AFTGGPATFTVDNWTA B.licheniformis F SF IRT AN T Q S A N L N IR D F T N YLAD S K QWLSK T K Y VS S V E F G T E V F- G GTGQI N I SN W DV T.reesei Y SF VAQ TN T T N Y S G D VK N F F N YLRD N K GYNAA G Q Y VL S Y Q F G T E P FT G S-GTL N V AS W TA S.lividans L SF VAP SA I S G W S F D VM D F V R A-TV A R GLAEN D W Y LT S V Q A G F E P WQ N G-AGL A V NS F SS relatif negatif hidrofilik sehingga diprediksi kuat merupakan protein yang larut dalam air Gambar 18. Selain itu terlihat adanya satu segmen transmembran pada N terminal berdasarkan nilai kepercayaan yang direkomendasikan pada skala Kyte Doolittle, yaitu 1.6. Adanya satu segmen transmembran pada daerah N- terminal mengindikasikan bahwa protein tersebut disekresikan Clavarie Notredame 2003. Hasil ini dikuatkan dengan analisis menggunakan TMHMM Gambar 19 yang menyimpulkan bahwa EglA A. niger IPB1 merupakan protein di luar sel. Gambar 18 Profil hidrofobisitas menggunakan skala Kyte Doolittle Protscale Gambar 19 Prediksi segmen transmembran TMHMM 4.3.6 Kekerabatan EglA A.niger IPB1 dengan endoglukanase anggota famili GH12 lainnya berdasarkan struktur asam aminonya. Analisis filogenetik dilakukan untuk menggambarkan hubungan kedekatan gen eglA A. niger IPB1 dengan gen-gen endoglukanase famili GH 12 lainnya. Analisis ini dilakukan dengan membandingkan gen eglA A. niger IPB1 dengan gen lainnya berdasarkan nilai kesamaan sekuennya. Analisis kesamaan EglA A.niger IPB1 berdasarkan urutan asam aminonya dilakukan terhadap beberapa endoglukanase dari anggota famili GH12. EglA A. niger IPB1 mempunyai kesamaan tertinggi, 99, dengan endoglukanase A A. niger database. EglA juga menunjukkan kesamaan yang tinggi dengan endoglukanase kelompok Aspergillus lainnya, yaitu 63 dengan A.aculaetus dan 60 dengan A. kawachi. Sementara itu kesamaan eglA A. niger IPB1 dengan kelompok bakteri dan archaea adalah kecil. A. niger IPB1 mempunyai kesamaan 18 dengan S .lividans dan 15 dengan P. furiosus. Kesamaan antar anggota famili GH12 ini merupakan hasil penyejajaran keseluruhan urutan gen GH12 yang meliputi daerah dengan similaritas tinggi dan daerah beragam. Hasil penyejajaran menunjukkan daerah yang mempunyai similaritas tinggi terletak pada domain katalitik sedangkan diluar domain katalitik sangat bervariasi Lampiran 7. Pohon filogenetik yang menggambarkan tingkat kekerabatan endoglukanase beberapa anggota famili GH12 dikonstruksi menggunakan program PHYLIP berdasarkan hasil multiple sequence alignment famili GH12 dengan program T-COFFEE yang mempunyai tingkat akurasi tinggi Edgar Badzoglou 2006. Secara garis besar, gen-gen endoglukanase terlihat mengelompok sesuai dengan taksonnya, yaitu bakteri, cendawan dan archaea Gambar 20. Kelompok cendawan terbagi menjadi tiga subfamili, yaitu subfamili1 yang terdiri dari kelompok Ascomycetes A. aculeatus, A. kawachi, A. niger, Fusarium equiseti, Bionectrica ochroleuca, T. viride, T. reesei , subfamili2 yang terdiri dari beberapa kelompok Ascomycetes A. oryzae dan A. nidulans dan Oomycetes Phytophthora sojae dan Phytophthora ramomum, dan subfamili3 terdiri dari kelompok Basidiomycetes Phanerochaete crhysosporium dan Polyporus arcularius . Gambar 20 Pohon filogenetik beberapa endoglukanase anggota famili GH12 Fungi Bakteri Archaea Ascomycetes Ascomycetes Oomycetes Basidiomycetes

V. SIMPULAN DAN SARAN 5.1 Simpulan

Nisbah selulolitik terbesar ditunjukkan oleh isolat A. niger KB12, diikuti berturut-turut oleh isolat A. niger TSR52, A. niger IPB1 dan A. niger TSR12. Namun demikian isolat A. niger IPB1 menunjukkan aktivitas spesifik tertinggi, yaitu sebesar 5.74 Umg, dibanding isolat-isolat lainnya. Gen eglA dari A. niger IPB1 berhasil diisolasi dan menunjukkan kesamaan nukleotida yang tinggi dengan endoglukanase dari A. niger dari database. Hasil karakterisasi menunjukkan eglA dari A. niger IPB1 merupakan protein yang disekresikan dan termasuk dalam anggota famili Glikosida Hidrolase famili 12 dengan residu Glu116 dan Glu 204 berturut-turut sebagai nukleofil dan donor proton.

5.2 Saran