Sintesis cDNA total Isolasi gen penyandi endoglukanase A. niger IPB1 .1 Isolasi RNA total
menit. Reaksi PCR dilakukan dengan campuran dan kondisi reaksi yang sama dengan isolasi cDNA eglA.
Koloni putih yang menghasilkan pita sesuai dengan ukuran fragmen cDNA sisipan setelah PCR terhadap koloni digunakan sebagai bahan untuk isolasi
plasmid yang akan dianalisis lebih lanjut. Plasmid diisolasi dari E. coli DH5α transforman rekombinan menggunakan prosedur Suharsono 2002. E. coli
ditumbuhkan dalam 2 ml media LB dan diinkubasi dalam inkubator beragitasi 250 rpm pada suhu 37
o
C semalam. Kultur bakteri di sentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm pada suhu 4
o
C selama 10 menit. Pelet disuspensikan dengan 100 l coldTEG buffer 50 mM glukosa, 25 mM Tris pH 8, 10 mM EDTA,
ditambahkan 200 l NaOHSDS buffer 1 N NaOH, 1 SDS, dibolak-balik perlahan dan diinkubasi dalam es selama 5 menit, selanjutnya ditambahkan 300 l
icecalsal buffer 3 M NaOAc, 11.5 asam asetat glasial, ddH
2
O, dihomogenkan dan disimpan dalam es selama 3 menit. Larutan disentrifugasi 12000 rpm pada
suhu 4
o
C selama 10 menit. Supernatan disuspensikan dengan 1x volume PCI fenol:kloroform:isoamil alkohol 25:24:1, diinkubasi selama 10 menit pada
suhu ruang dan selanjutnya disentrifugasi 12000 rpm selama 10 menit. Supernatan ditambah 2x volume etanol absolut, diinkubasi selama 2 jam di freezer dan
selanjutnya disentrifugasi 12000 rpm selama 10 menit. Pelet dikeringkan dan kemudian ditambahkan 30 l ddH
2
O. RNA didegradasi dengan menambahkan 100 ppm RNAse dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 30 menit. Plasmid dielektroforesis di agarosa 1 bv dalam bufer TAE 1x 40 mM Tris-asetat, 1
mM EDTA pada tegangan 100 volt selama 30 menit.